DNAポリメラーゼによる核塩基修飾ヌクレオチドのプロセシングに関する構造的洞察

DNAポリメラーゼ触媒修飾ヌクレオチドの組み込みは、次世代シーケンス、核酸ベースの診断、転写分析、および指数増幅によるリガンドの系統的濃縮によるアプタマー選択（SELEX）などの主要な重要性の多くの生物学的技術で採用されています。最近の研究では、染料、親和性タグ、スピン、レドックスラベルなどの核塩基での修飾で官能化された2'-デオキシヌクレオシド三リン酸（DNTP）が、DNAポリメラーゼの基質であることが示されています。使用済み。ヌクレオチドで修飾が導入される位置は、DNAポリメラーゼの基質活性を保持するために重要であると特定されています。通常、修飾は、ピリミジンのC5位置と7次元のC7位置に付着します。さらに、修飾の性質は、DNAポリメラーゼによる新生のDNA鎖への修飾ヌクレオチドの取り込みの効率に影響を与える可能性があることが示されています。この説明は、最近得られた構造データのコンテキストにおけるDNAポリメラーゼによる修飾ヌクレオチドの取り込みの研究で得られた機能データを配置します。プライマーテンプレートDNAといくつかの修飾されたヌクレオチドを備えた三元複合体におけるThermus acquaticus（Taq）DNAポリメラーゼバリアント（すなわち、クレンタックDNAポリメラーゼ）の結晶構造分析は、ヌクレオベース修飾的なトリプリン酸がどのように耐性があるかについての最初の構造的洞察を提供しました。かさばる修飾は、修飾が活性部位の外側に拡張できるようにするタンパク質の空洞の結果として、Klentaq DNAポリメラーゼによって処理されることがわかりました。さらに、酵素は柔軟な方法で異なる修飾に適応できることを発見し、ヌクレオチド修飾の性質に応じて、活性部位で異なるアミノ酸側鎖構造を採用することがわかりました。異なる「戦略」（つまり、水素結合、陽イオン-π相互作用）により、タンパク質は、複合体の全体的な構造を大幅に変えることなく、それぞれのタンパク質基質複合体を安定させることができます。興味深いことに、3'-プライマー末端も非修飾された天然のヌクレオチドではなく修飾されたヌクレオチドである場合、修飾されたヌクレオチドがクレンタクDNAポリメラーゼによってより効率的に処理される可能性があることも発見されました。実際、隣接する位置での2つの修飾されたヌクレオチドの修飾は、互いに相互作用することができ（すなわち、π-π相互作用によって）、それにより酵素 - 基質複合体を安定させ、より効率的な変換をもたらします。いくつかの研究では、シーケンスファミリーBに属するアーキールDNAポリメラーゼは、ファミリーAの酵素よりもヌクレバーゼ修飾ヌクレオチドの取り込みにより適していることが示されています。ただし、ファミリーB DNAポリメラーゼでは、より少ない構造データが利用可能であることが示されています。ファミリーBのメンバーによる修正基質の好みに関する洞察を得るために、9°NおよびKOD DNAポリメラーゼのバイナリ構造をプライマーテンプレートDNAに結合したことに成功しました。ArchealファミリーB DNAポリメラーゼの主要な溝は、ファミリーA DNAポリメラーゼよりもアクセスしやすいことがわかりました。これは、ピリミジンのC5や7-デザプリンのC7の修飾など、主要な溝に位置する重合ヌクレオチドにおけるファミリーB DNAポリメラーゼの観察された優位性を説明するかもしれません。全体として、この説明は、修飾されたヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって処理されるメカニズムに関する構造的洞察を提供する最近の調査結果をまとめたものです。これは、修飾されたヌクレオチドの設計に関するガイドラインを提供し、DNAポリメラーゼによる修飾ヌクレオチドの受け入れに基づいた将来の努力をサポートします。

The DNA polymerase-catalyzed incorporation of modified nucleotides is employed in many biological technologies of prime importance, such as next-generation sequencing, nucleic acid-based diagnostics, transcription analysis, and aptamer selection by systematic enrichment of ligands by exponential amplification (SELEX). Recent studies have shown that 2'-deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) that are functionalized with modifications at the nucleobase such as dyes, affinity tags, spin and redox labels, or even oligonucleotides are substrates for DNA polymerases, even if modifications of high steric demand are used. The position at which the modification is introduced in the nucleotide has been identified as crucial for retaining substrate activity for DNA polymerases. Modifications are usually attached at the C5 position of pyrimidines and the C7 position of 7-deazapurines. Furthermore, it has been shown that the nature of the modification may impact the efficiency of incorporation of a modified nucleotide into the nascent DNA strand by a DNA polymerase. This Account places functional data obtained in studies of the incorporation of modified nucleotides by DNA polymerases in the context of recently obtained structural data. Crystal structure analysis of a Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase variant (namely, KlenTaq DNA polymerase) in ternary complex with primer-template DNA and several modified nucleotides provided the first structural insights into how nucleobase-modified triphosphates are tolerated. We found that bulky modifications are processed by KlenTaq DNA polymerase as a result of cavities in the protein that enable the modification to extend outside the active site. In addition, we found that the enzyme is able to adapt to different modifications in a flexible manner and adopts different amino acid side-chain conformations at the active site depending on the nature of the nucleotide modification. Different "strategies" (i.e., hydrogen bonding, cation-π interactions) enable the protein to stabilize the respective protein-substrate complex without significantly changing the overall structure of the complex. Interestingly, it was also discovered that a modified nucleotide may be more efficiently processed by KlenTaq DNA polymerase when the 3'-primer terminus is also a modified nucleotide instead of a nonmodified natural one. Indeed, the modifications of two modified nucleotides at adjacent positions can interact with each other (i.e., by π-π interactions) and thereby stabilize the enzyme-substrate complex, resulting in more efficient transformation. Several studies have indicated that archeal DNA polymerases belonging to sequence family B are better suited for the incorporation of nucleobase-modified nucleotides than enzymes from family A. However, significantly less structural data are available for family B DNA polymerases. In order to gain insights into the preference for modified substrates by members of family B, we succeeded in obtaining binary structures of 9°N and KOD DNA polymerases bound to primer-template DNA. We found that the major groove of the archeal family B DNA polymerases is better accessible than in family A DNA polymerases. This might explain the observed superiority of family B DNA polymerases in polymerizing nucleotides that bear bulky modifications located in the major groove, such as modification at C5 of pyrimidines and C7 of 7-deazapurines. Overall, this Account summarizes our recent findings providing structural insight into the mechanism by which modified nucleotides are processed by DNA polymerases. It provides guidelines for the design of modified nucleotides, thus supporting future efforts based on the acceptance of modified nucleotides by DNA polymerases.