オリゴマイシン治療細胞におけるミトコンドリア電子輸送システムの最大能力の過小評価

無傷の細胞におけるミトコンドリア電子輸送システム（ETS）の最大能力は、オリゴマイシンによる酸化的リン酸化の阻害に先行するプロトノフォア誘導の最大酸素消費を促進することにより頻繁に推定されます。本研究では、ヒト神経膠腫（T98GおよびU-87MG）および前立腺癌（PC-3）細胞を異なる濃度のプロトノフォアCCCPで滴定して、従来の成長媒​​体で呼吸器内で最大酸素消費率（OCR）を誘導しました。結果は、オリゴマイシンまたはそのA異性体の存在が最大ETS容量の過小評価につながることを示しています。オリゴマイシンの存在下では、予備の呼吸能力（SRC）、つまり最大細胞OCRと基底細胞OCRの違いが25〜45％過小評価されました。SRCに対するオリゴマイシンの阻害効果は、T98G細胞でより顕著であり、懸濁細胞と付着細胞の両方で観察されました。SRCの過小評価は、ATPシンターゼ阻害剤シトレビリジンによって酸化的リン酸化が完全に阻害された場合にも発生しました。さらなる実験では、オリゴマイシンはアデニンヌクレオチドトランスリカーゼ阻害剤Bongkrekic酸またはカルボキシ糖症に置き換えることができないことが示されました。なぜなら、これらの化合物は透過化された細胞に効果があるが、INTAC細胞での酸化的リン酸化を阻害しないからです。CCCPをFCCPに置き換えました。FCCP、別の強力なプロトノフォアと同様の結果が観察されました。より低い最大OCRおよびSRC値は、より弱いプロトノフォア2,4-ジニトロフェノールで得られ、これらのパラメーターはオリゴマイシンの存在の影響を受けませんでした。呼吸器基質とインキュベートした透過化された細胞または単離された脳ミトコンドリアでは、CCCP誘発性の最大OCRに対するオリゴマイシンの軽微な阻害効果のみが観察されました。以前に検証されたプロトコルが採用されていない限り、無傷の細胞の最大ETS容量はオリゴマイシンなしで推定されるべきであると結論付けます。強力なプロトノフォア誘発性の最大OCRに対するATPシンターゼブロッカーの阻害効果は、ミトコンドリア呼吸器基質の代謝障害と関連している可能性があります。

The maximal capacity of the mitochondrial electron transport system (ETS) in intact cells is frequently estimated by promoting protonophore-induced maximal oxygen consumption preceded by inhibition of oxidative phosphorylation by oligomycin. In the present study, human glioma (T98G and U-87MG) and prostate cancer (PC-3) cells were titrated with different concentrations of the protonophore CCCP to induce maximal oxygen consumption rate (OCR) within respirometers in a conventional growth medium. The results demonstrate that the presence of oligomycin or its A-isomer leads to underestimation of maximal ETS capacity. In the presence of oligomycin, the spare respiratory capacity (SRC), i.e., the difference between the maximal and basal cellular OCR, was underestimated by 25 to 45%. The inhibitory effect of oligomycin on SRC was more pronounced in T98G cells and was observed in both suspended and attached cells. Underestimation of SRC also occurred when oxidative phosphorylation was fully inhibited by the ATP synthase inhibitor citreoviridin. Further experiments indicated that oligomycin cannot be replaced by the adenine nucleotide translocase inhibitors bongkrekic acid or carboxyatractyloside because, although these compounds have effects in permeabilized cells, they do not inhibit oxidative phosphorylation in intact cells. We replaced CCCP by FCCP, another potent protonophore and similar results were observed. Lower maximal OCR and SRC values were obtained with the weaker protonophore 2,4-dinitrophenol, and these parameters were not affected by the presence of oligomycin. In permeabilized cells or isolated brain mitochondria incubated with respiratory substrates, only a minor inhibitory effect of oligomycin on CCCP-induced maximal OCR was observed. We conclude that unless a previously validated protocol is employed, maximal ETS capacity in intact cells should be estimated without oligomycin. The inhibitory effect of an ATP synthase blocker on potent protonophore-induced maximal OCR may be associated with impaired metabolism of mitochondrial respiratory substrates.