ハンティンティンmRNAにおける変異CAGの拡大は、その最初のエクソンのエクソヌクレリ溶解性切断を妨害しますか？

背景：RNA干渉（RNAI）による変異体ハンティンティンmRNAのサイレンシングは、ハンチントン病の治療戦略です。RNAiは、標的HTT mRNAの特定のエンド核分解性切断を誘導し、それに続いて切断されたmRNAフラグメントのエクソヌクレリ溶解処理を行います。 目的：特定のハンチンチンmRNA配列が持続するかどうかを確認するために、RNAI後のハンチチンmRNA切断産物のクリアランスを調査しました。特に、拡大したCAGが、ヒト変異体ハンチティンエクソン1 mRNAの分解を妨げることにより、有毒mRNA種の産生を増加させるかどうかを知りたいと思いました。 方法：128のCAGリピート（YAC128マウス）を含むヒト変異体HTT導入遺伝子を発現するマウスを、Huntintin mRNA（SCAAV-U6-MIRNA-HTT-GFP）のエクソン48を標的とするmiRNAを運ぶ自己補体AAV9ベクターを持つ線条体に注入しました。トランスジェニックハンチチンmRNAレベルは、2週間後に線条体溶解物で測定されました。QPCRには、オープンリーディングフレームに沿って6つの位置と人間のハンティンティンmRNAの翻訳されていない領域に沿って、種固有のプライマープローブの組み合わせを使用しました。ノックダウンは、尾静脈注入後の肝臓でも測定されました。 結果：SCAAV9-U6-MIRNA-HTT-GFPのストリア内投与の2週間後、ハンチチンmRNAに沿って6つの異なる部位を標的とするプローブを使用して、線条体のトランスジェニック変異体ハンチチンを測定しました。リアルタイムPCRは、ヒトHTTで29％から36％の減少を示しました。エクソン1を含む6つのサイトのいずれかで測定されたノックダウンに有意な差はありませんでした。肝臓では、未処理のマウスと比較して、より顕著なHTT mRNAノックダウンが70％〜76％であることが観察されました。また、間に有意差はありませんでした。サイト。 結論：我々の結果は、RNAi誘発性切断後のヒト変異体ハンチティンmRNA全体に分解が等しく分布していることを示しています。

BACKGROUND: Silencing mutant huntingtin mRNA by RNA interference (RNAi) is a therapeutic strategy for Huntington's disease. RNAi induces specific endonucleolytic cleavage of the target HTT mRNA, followed by exonucleolytic processing of the cleaved mRNA fragments. OBJECTIVES: We investigated the clearance of huntingtin mRNA cleavage products following RNAi, to find if particular huntingtin mRNA sequences persist. We especially wanted to find out if the expanded CAG increased production of a toxic mRNA species by impeding degradation of human mutant huntingtin exon 1 mRNA. METHODS: Mice expressing the human mutant HTT transgene with 128 CAG repeats (YAC128 mice) were injected in the striatum with self-complementary AAV9 vectors carrying a miRNA targeting exon 48 of huntingtin mRNA (scAAV-U6-miRNA-HTT-GFP). Transgenic huntingtin mRNA levels were measured in striatal lysates after two weeks. For qPCR, we used species specific primer-probe combinations that together spanned 6 positions along the open reading frame and untranslated regions of the human huntingtin mRNA. Knockdown was also measured in the liver following tail vein injection. RESULTS: Two weeks after intrastriatal administration of scAAV9-U6-miRNA-HTT-GFP, we measured transgenic mutant huntingtin in striatum using probes targeting six different sites along the huntingtin mRNA. Real time PCR showed a reduction of 29% to 36% in human HTT. There was no significant difference in knockdown measured at any of the six sites, including exon 1. In liver, we observed a more pronounced HTT mRNA knockdown of 70% to 76% relative to the untreated mice, and there were also no significant differences among sites. CONCLUSIONS: Our results demonstrate that degradation is equally distributed across the human mutant huntingtin mRNA following RNAi-induced cleavage.