λエキソヌクレアーゼと統合するグラフェン酸化物に基づくアルカリホスファターゼ活性の蛍光アッセイ

アルカリホスファターゼ（ALP）アッセイの新規蛍光ターンオン戦略は、グラフェン酸化グラフェン（GO）から一本鎖DNA（SSDNA）への優先的な結合に基づいて開発されました。具体的には、ALPが非存在している場合、3 '末端（F-DNA）にフルオロフォアを備えた1つのオリゴヌクレオチドによって構築された基質-DSNAと5'-ホスホリル末端（P-DNA）で修飾された相補的配列は、λEXOによって即座に切断され、F-dnaは誘導になります。一方、ALPの導入はP-DNAの加水分解につながり、生成5'-ヒドロキシルエンド製品はλEXO切断を妨げ、DSDNAのGOとの弱い結合により有意な蛍光増強を誘導します。最適化された条件下では、このアプローチは0.19 U/Lの検出限界でALPに対して高い感度と特異性を示し、スパイクされたヒト血清サンプルにおけるALPの測定も実現されています。特に、この新しいアプローチは、ALPアクティビティ検出のための斬新で敏感なプラットフォームを提供するだけでなく、特定の結合要素なしでタンパク質の検出のためのGOベースのバイオセンシングの利用を促進し、したがってGOベースのセンシングアプリケーションを新しいフィールドに拡張します。

A novel fluorescence turn-on strategy for the alkaline phosphatase (ALP) assay is developed based on the preferential binding of graphene oxide (GO) to single-stranded DNA (ssDNA) over double-stranded DNA (dsDNA) coupled with λ exonuclease (λ exo) cleavage. Specifically, in the absence of ALP, the substrate-dsDNA constructed by one oligonucleotide with a fluorophore at the 3'-end (F-DNA) and its complementary sequence modified with a 5'-phosphoryl termini (p-DNA), is promptly cleaved by λ exo, and the resulting F-DNA is adsorbed on GO surface, allowing fluorescence quenching. Whereas the introduction of ALP leads to the hydrolysis of the P-DNA, and the yielding 5'-hydroxyl end product hampers the λ exo cleavage, inducing significant fluorescence enhancement due to the weak binding of dsDNA with GO. Under the optimized conditions, the approach exhibits high sensitivity and specificity to ALP with a detection limit of 0.19 U/L, and the determination of ALP in spiked human serum samples has also been realized. Notably, this new approach not only provides a novel and sensitive platform for the ALP activity detection but also promotes the exploitation of the GO-based biosensing for the detection of the protein with no specific binding element, and thus extending the GO-based sensing applications into a new field.