RGDモチーフを含めることは、Invasin Integrin結合の親和性と特異性を変化させます

invasinは、感染の初期段階を媒介するYersinia enterocoliticaとY. Y. pseudotuberculosisの外膜に示される重要なアドヘシンです。Invasinは、β1インテグリンを結合することにより、小腸の微小（M）細胞を特異的に標的にし、Yersinia、Escherichia、LaTexビーズを含むinvasinコーティングされた粒子の真核生物の取り込みを引き起こすのに十分です。その結果、Invasinはワクチンやその他の生物学の経口分娩を仲介することに関心を生み出しました。インテグリン結合親和性は、粒子の取り込みと相関することが示されています。したがって、私たちは、親和性が高いインベイジンバリアントが内在化の強化をもたらすと仮定しました。最初に表面に露出したチロシン残基のアラニンスキャンを行い、インテグリン結合に寄与するものを特定しました。2つの残基を特定しました。これは、アラニンで置換されると、可溶性α5β1インテグリンへの結合を減少させました。次に、結合に寄与することが知られているこれらおよび他の残基に及ぶ4つの標的変異誘発ライブラリーを構築し、その後、CACO-2細胞浸潤を媒介し、可溶性α5β1インテグリンを結合できるバリアントの濃縮が続きました。フローサイトメトリーとELISAアッセイで測定されたα5β1インテグリン結合親和性を増加させる3つのアミノ酸置換を特定しました。そのうち2つは、結合に重要なD911残基を囲む新規RGDモチーフを作成しました。このバリアントは、大腸菌表面で発現した場合、CACO-2細胞ではなく、CHO細胞への内在化の強化を付与します。さらなる分析により、RGDを含めることでインフシン - インテグリンの特異性が拡大し、それによって細胞選択性に影響を与えることが示されました。この研究は、他の多くのアドヘシンに存在するインビセンにRGDモチーフの欠如についての分子の説明を提供します。

Invasin is a key adhesin displayed on the outer membrane of Yersinia enterocolitica and Y. pseudotuberculosis that mediates the initial stages of infection. Invasin specifically targets microfold (M) cells in the small intestine by binding β1 integrins and is sufficient to trigger eukaryotic uptake of invasin-coated particles, including Yersinia, Escherichia coli, and latex beads. As a result, invasin has generated interest to mediate oral delivery of vaccines and other biologics. Integrin binding affinity has been shown to correlate with particle uptake; thus we hypothesized that invasin variants with higher affinity would confer enhanced internalization. We first performed alanine scanning of surface-exposed tyrosine residues to identify those contributing to integrin binding. We identified two residues, which, when substituted with alanine, reduced binding to soluble α5β1 integrin. Next, we constructed four targeted mutagenesis libraries spanning these and other residues known to contribute to binding, followed by enrichment of variants able to mediate Caco-2 cellular invasion and to bind soluble α5β1 integrin. We identified three amino acid substitutions that increased α5β1 integrin binding affinity as measured by flow cytometry and ELISA assays, two of which created a novel RGD motif surrounding the D911 residue critical for binding. This variant confers enhanced internalization into CHO cells but not Caco-2 cells when expressed on the E. coli surface. Further analysis showed that inclusion of an RGD expands invasin-integrin specificity, thereby impacting cellular selectivity. This work provides a molecular explanation for the lack of an RGD motif in invasin that is present in many other adhesins.