FLT1のエクトドメイン切断は受容体の活性化と機能を調節し、その下流の細胞内切断には必要ありません

FLT1は、VEGFとPLGFに結合し、細胞外環状環境におけるVEGFの効果に敵対するように切断される細胞表面VEGF受容体です。FLT1処理をさらに評価するために、HEK293およびCOS7細胞でタグ付きFLT1コンストラクトを発現し、削除マッピングにより、切断部位が残基759および763の間の膜貫通ドメイン（TMD）に隣接していることを示しました。培地と我々は、切断部位が別の膜貫通受容体にも移動できることを示します。エクトドメイン切断の下流の2番目の切断イベントは、サイトゾルC末端FLT1フラグメントを放出し、FLT1のこの細胞内切断は、外骨の切断の廃止以来、上流のエクトドメイン切断によって触媒または調節されていません。下流の切断イベントは、γ-セクレターゼ阻害剤の影響を受けにくく、プレセニリン1の過剰発現は、γ-セクレターゼの触媒サブユニットは下流の細胞内切断イベントを変化させませんでした。さらに、この切断は、FLT1のTMDで以前に公開されたバリン残基（767V）を介して発生しなかったため、別の切断経路の存在を示しています。P44/42 MAPキナーゼの活性化に対するエクトドメイン切断の影響をテストし、野生型FLT1と比較して、切断耐性FLT1コンストラクトがp44/42 MAPキナーゼ活性化を刺激できなかったことを示しています。我々の結果は、FLT1エクトドメイン切断が細胞外環境での遊離VEGFの利用可能性を調節するだけでなく、ERKキナーゼ経路を介した細胞シグナル伝達を調節することを示しています。

FLT1 is a cell surface VEGF receptor which is cleaved to release an N-terminal ectodomain which binds VEGF and PlGF and can antagonize the effects of VEGF in the extracellular milieu. To further evaluate FLT1 processing we expressed tagged FLT1 constructs in HEK293 and COS7 cells where we demonstrate, by deletion mapping, that the cleavage site is immediately adjacent to the transmembrane domain (TMD) between residues 759 and 763. Cleavage reciprocally regulates free VEGF in conditioned media and we show that the cleavage site is also transferable to another transmembrane receptor. A second cleavage event downstream of the ectodomain cleavage releases a cytosolic C-terminal FLT1 fragment and this intracellular cleavage of FLT1 is not catalyzed or regulated by the upstream ectodomain cleavage since abolition of the ectodomain cleavage has no impact on the downstream cleavage event. The downstream cleavage event is not susceptible to γ-secretase inhibitors and overexpression of presenilin 1, the catalytic subunit of γ-secretase did not change the downstream intracellular cleavage event. Furthermore, this cleavage did not occur via a previously published valine residue (767V) in the TMD of FLT1, indicating the existence of another cleavage pathway. We tested the impact of the ectodomain cleavage on p44/42 MAP kinase activation and demonstrate that compared to wild type FLT1, cleavage resistant FLT1 constructs failed to stimulate p44/42 MAP kinase activation. Our results indicate that FLT1 ectodomain cleavage not only regulates the availability of free VEGF in the extracellular milieu but also regulates cellular signaling via the ERK kinase pathway.