UHRF1のSRAドメインを標的とするタンデム仮想スクリーニングは、DNAメチル化を調節する新しい化学物質ツールを識別します

PHDおよび薬指ドメイン1を含むユビキチン様タンパク質UHRF1は、複製によるDNAメチル化状態の維持を可能にする重要なエピジェネティックタンパク質です。UHRF1の5-メチルシトシンポケットに結合し、その機能を阻害できる小分子を識別するために、タンデム仮想スクリーニングアプローチが実装されました。NCI/DTP小分子リポジトリは、構造ベースとリガンドベースの方法論を実装する組み合わせプロトコルにより、シリコでスクリーニングされました。コンセンサスランキングを利用して、PCR-MSおよびHPLC-MS/MSを使用してセルロのDNAを脱メチル化する能力について、その後実験的に評価された27のトップランク化合物のセットを選択しました。最も活性な分子は、近接結紮でのin situアッセイとアポトーム技術により、細胞ベースの設定でさらに評価されました。両方の評価により、DNMT1/UHRF1の相互作用は、U251神経膠腫細胞と最も強力なNSC232003との4時間のインキュベーション後に大幅に減少し、15μMで50％の相互作用阻害が示され、ELISAによって測定されたグローバルなDNA細胞質脱メチル化の誘導が示されたことが確認されました。。これは、DNMT1/UHRF1相互作用を潜在的に破壊することにより、UHRF1を標的とし、細胞のコンテキストでDNAメチル化を調節する化学ツールの最初の報告です。NCI/DTPリポジトリが自由に利用できるウラシル誘導体である化合物NSC232003は、DNAメチル化遺伝の解剖を可能にする非常に強力で細胞透過性UHRF1阻害剤を開発するための汎用性のあるリードを提供します。

Ubiquitin-like protein UHRF1 that contains PHD and RING finger domain 1 is a key epigenetic protein enabling maintenance of the DNA methylation status through replication. A tandem virtual screening approach was implemented for identifying small molecules able to bind the 5-methylcytosine pocket of UHRF1 and inhibit its functionality. The NCI/DTP small molecules Repository was screened in silico by a combined protocol implementing structure-based and ligand-based methodologies. Consensus ranking was utilized to select a set of 27 top-ranked compounds that were subsequently evaluated experimentally in a stepwise manner for their ability to demethylate DNA in cellulo using PCR-MS and HPLC-MS/MS. The most active molecules were further assessed in a cell-based setting by the Proximity Ligation In Situ Assay and the ApoTome technology. Both evaluations confirmed that the DNMT1/UHRF1 interactions were significantly reduced after 4 h of incubation of U251 glioma cells with the most potent compound NSC232003, showing a 50% interaction inhibition at 15 μM as well as induction of global DNA cytosine demethylation as measured by ELISA. This is the first report of a chemical tool that targets UHRF1 and modulates DNA methylation in a cell context by potentially disrupting DNMT1/UHRF1 interactions. Compound NSC232003, a uracil derivative freely available by the NCI/DTP Repository, provides a versatile lead for developing highly potent and cell-permeable UHRF1 inhibitors that will enable dissection of DNA methylation inheritance.