Artemisia annua lのフラバノン3-ヒドロキシラーゼ遺伝子の分子クローニングと特性評価

フラボノイドは、中国の非常に重要な経済作物であるArtemisia Annuaの抗マラリアおよび抗がん化合物を相乗化することがわかった。Artemisia Annuaのフラボノイドの調節メカニズムを発見するために、フラバノン3-ヒドロキシラーゼ（F3H）の全長cDNAを、人種を使用して初めてArtemisia Annuaから分離しました（cDNA端の急速な増幅）。AAF3Hの完成したオープンリードフレームは1095 bpで、41.18 kDaの予測分子量と5.67のPIを含む364アミノ酸タンパク質をコードしました。AAF3Hの組換えタンパク質は、Hisタグ付きタンパク質として大腸菌BL21（DE3）で発現し、Ni-NTAアグロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製され、機能的にin vitroで特徴付けられました。結果は、Hisタグ付きタンパク質（AAF3H）が、Fe（2+）の現在においてナリンゲニンをジヒドロカエンペフェロールに触媒したことを示しました。ナリンゲニンのkmは218.03μmでした。AAF3H反応の最適pHはpH 8.5であると決定され、最適温度は35°Cであると判断されました。AAF3H転写産物は、フラボノイドのレベルが低いレベルのフラボノイドよりも高いレベルのフラボノイドを持つ品種に蓄積されていることがわかりました。これは、AAF3Hが代謝工学を通じてArtemisia Annuaにおけるフラボノイド生合成の調節の潜在的な標的であることを意味しました。

Flavonoids were found to synergize anti-malaria and anti-cancer compounds in Artemisia annua, a very important economic crop in China. In order to discover the regulation mechanism of flavonoids in Artemisia annua, the full length cDNA of flavanone 3-hydroxylase (F3H) were isolated from Artemisia annua for the first time by using RACE (rapid amplification of cDNA ends). The completed open read frame of AaF3H was 1095 bp and it encoded a 364-amino acid protein with a predicted molecular mass of 41.18 kDa and a pI of 5.67. The recombinant protein of AaF3H was expressed in E. coli BL21(DE3) as His-tagged protein, purified by Ni-NTA agrose affinity chromatography, and functionally characterized in vitro. The results showed that the His-tagged protein (AaF3H) catalyzed naringenin to dihydrokaempferol in the present of Fe(2+). The Km for naringenin was 218.03 μM. The optimum pH for AaF3H reaction was determined to be pH 8.5, and the optimum temperature was determined to be 35 °C. The AaF3H transcripts were found to be accumulated in the cultivar with higher level of flavonoids than that with lower level of flavonoids, which implied that AaF3H was a potential target for regulation of flavonoids biosynthesis in Artemisia annua through metabolic engineering.