リンカーペイロードはどこに行きましたか？プラズマのマレイミドリンカーを使用した抗体薬物コンジュゲートからの放出されたリンカーペイロードの目的地に関する定量的調査

システインの反応性チオールは、マレイミド含有リンカーペイロードを抗体に結合するためによく使用され、抗体薬物コンジュゲート（ADC）の生成をもたらします。現在、薬物開発における多くのADCは、抗体上のネイティブまたは操作されたシステイン残基にリンカーペイロードを結合することにより行われています。ヒンジ - カイスタインを介してオーリスタチンペイロードに結合したADCは、この研究のモデルとして使用され、ADCの安定性に対するマレイミドリンカーの影響を理解しました。ペイロードは、プロテアーゼが切断可能なリンカーであるマレイミドカプロイル - バリン-Citruline-P-アミノベンジーロキシカルボニル（MCVC-PABC）によってトラスツズマブに共役しました。血漿安定性アッセイでは、ADC（トラスツズマブ-MCVC-PABC-Auristatin-0101）を144時間の時間コースで血漿とインキュベートした場合、測定された放出された自由ペイロード濃度と薬物の測定された損失の間に矛盾が観察されました。液体クロマトグラフィマス分光法（LC-MS）で測定される、抗体と抗体比（DAR）。144時間のADCが枯渇したヒト血漿からのペイロードの酵素放出は、DAR損失のほぼ100％を占めることができることがわかりました。無傷のタンパク質質量分析により、144時間の時点で、ADCが枯渇したヒト血漿中の主要タンパク質の質量は、ヒト血漿から抽出された天然アルブミンよりも1347 DAを追加し、リンカーペイロードの質量と正確に一致することが示されました。さらに、タンパク質ゲル電気泳動は、0 H血漿免疫沈降サンプルと比較して、144時間のADC枯渇および抗積積積型免疫沈降血漿サンプルに1つの濃縮タンパク質しか存在しないことを示しました。血清アルブミンの。さらに、アルブミン付加物は、in vivo Cynomolgus Monkeyプラズマでの投与後96時間および168時間でも同定されました。これらの結果は、脱共和化されたMC-VC-PABC-Auristatinの大部分が最終的に血清アルブミンに移され、長寿命のアルブミン結晶型給与付加物を形成することを強く示唆しています。私たちの知る限り、これは血清アルブミンへのリンカーペイロード移動の程度を定量的に特徴付けた最初のレポートであり、アルブミンリンカーペイロード付加物のin vivo形成の最初の明確な例です。

The reactive thiol of cysteine is often used for coupling maleimide-containing linker-payloads to antibodies resulting in the generation of antibody drug conjugates (ADCs). Currently, a numbers of ADCs in drug development are made by coupling a linker-payload to native or engineered cysteine residues on the antibody. An ADC conjugated via hinge-cysteines to an auristatin payload was used as a model in this study to understand the impact of the maleimide linkers on ADC stability. The payload was conjugated to trastuzumab by a protease-cleavable linker, maleimido-caproyl-valine-citruline-p-amino-benzyloxy carbonyl (mcVC-PABC). In plasma stability assays, when the ADC (Trastuzumab-mcVC-PABC-Auristatin-0101) was incubated with plasma over a 144-h time-course, a discrepancy was observed between the measured released free payload concentration and the measured loss of drug-to-antibody ratio (DAR), as measured by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). We found that an enzymatic release of payload from ADC-depleted human plasma at 144 h was able to account for almost 100% of the DAR loss. Intact protein mass analysis showed that at the 144 h time point, the mass of the major protein in ADC-depleted human plasma had an additional 1347 Da over the native albumin extracted from human plasma, exactly matching the mass of the linker-payload. In addition, protein gel electrophoresis showed that there was only one enriched protein in the 144 h ADC-depleted and antipayload immunoprecipitated plasma sample, as compared to the 0 h plasma immunoprecipitated sample, and the mass of this enriched protein was slightly heavier than the mass of serum albumin. Furthermore, the albumin adduct was also identified in 96 h and 168 h postdose in vivo cynomolgus monkey plasma. These results strongly suggest that the majority of the deconjugated mc-VC-PABC-auristatin ultimately is transferred to serum albumin, forming a long-lived albumin-linker-payload adduct. To our knowledge, this is the first report quantitatively characterizing the extent of linker-payload transfer to serum albumin and the first clear example of in vivo formation of an albumin-linker-payload adduct.