タンパク質構造とペルオキシダーゼ活性の両方で、ミオグロビン微調整で設計された分子内ジスルフィド結合

ジスルフィド結合は、タンパク質構造の安定化と微調整タンパク質機能において重要な役割を果たします。合理的なヘムタンパク質設計のアプローチを調査するために、ここでは、ミオグロビン（MB）の足場に一対のシステイン（F46C/M55C）を合理的に導入し、天然のニューログロビンのものを模倣しました。分子モデリングは、Cys46とCys55がESI-MS分析、DTNB反応、およびCDスペクトルによって実験的に確認された分子内ジスルフィド結合を形成することが可能であることを示唆しました。さらに、Cys46-Cys55の微調整の自発的に形成されたヘム活性部位構造だけでなく、タンパク質機能も形成されることが示されました。F46S MBでのPHE46をSer46に置換すると、H2O2の活性化が促進され、タンパク質が不安定になります。驚くべきことに、F46C/M55C MBにおけるCys46-Cys55の分子内ジスルフィド結合の形成は、タンパク質の安定性を改善し、ヘム部位を調節し、基質結合により有利になり、ペルオキシダーゼ活性が強化されます。この研究は、分子内ジスルフィド結合によって調節されるヘムタンパク質の構造機能関係の貴重な情報を提供し、そのような共有結合の構築は機能性ヘムタンパク質の設計に有用であることを示唆しています。

Disulfide bond plays crucial roles in stabilization of protein structure and in fine-tuning protein functions. To explore an approach for rational heme protein design, we herein rationally introduced a pair of cysteines (F46C/M55C) into the scaffold of myoglobin (Mb), mimicking those in native neuroglobin. Molecular modeling suggested that it is possible for Cys46 and Cys55 to form an intramolecular disulfide bond, which was confirmed experimentally by ESI-MS analysis, DTNB reaction and CD spectrum. Moreover, it was shown that the spontaneously formed disulfide bond of Cys46-Cys55 fine-tunes not only the heme active site structure, but also the protein functions. The substitution of Phe46 with Ser46 in F46S Mb destabilizes the protein while facilitates H2O2 activation. Remarkably, the formation of an intramolecular disulfide bond of Cys46-Cys55 in F46C/M55C Mb improves the protein stability and regulates the heme site to be more favorable for substrate binding, resulting in enhanced peroxidase activity. This study provides valuable information of structure-function relationship for heme proteins regulated by an intramolecular disulfide bond, and also suggests that construction of such a covalent bond is useful for design of functional heme proteins.