CRISPR/CAS9を使用した特定のホモ接合およびヘテロ接合変異の効率的な導入

細菌CRISPR/CAS9システムは、多くの生物で配列固有の遺伝子編集を可能にし、たとえば、ヒト多能性幹細胞でヒト疾患のモデルを生成するためのツールとして有望です。CRISPR/CAS9は、高効率でターゲットを絞った二本鎖切断（DSB）を導入します。これは通常、非同種エンド結合（NHEJ）によって修復され、非特異的な挿入、欠失、またはその他の変異（インデル）をもたらします。DSBは、導入された一本鎖DNAヌクレオチド（SSODN）などのDNA修復テンプレートを使用して、相同性指向修復（HDR）によって修復され、特定の変異のノックインを可能にすることもできます。CRISPR/CAS9はNHEJを介して遺伝子ノックアウトをエンジニアリングするために広く使用されていますが、HDRによる編集は非効率的であり、追加のインデルによって破損する可能性があり、疾患関連の変異を導入することで遺伝的障害をモデル化するための広範な使用を防ぎます。さらに、ヘテロ接合変異によって引き起こされる疾患をモデル化するために、単一の対立遺伝子での標的変異ノックインは報告されていません。ここでは、CRISPR/CAS9ベースのゲノム編集フレームワークについて説明します。これにより、高効率と精度を備えたモノアレンシーケンスの変化を選択的に導入できます。病原性変異とともにサイレントCRISPR/CASブロッキング変異を組み込むことにより、HDRの精度が劇的に増加し、傷のないゲノム編集のために「正しい」と呼ばれる方法を確立することを示します。突然変異の取り込み速度とDSBへの距離との間のステレオタイプの逆の関係を特徴付けて活用することにより、酸性の予測可能な制御を達成します。ホモ接合の紹介では、意図した突然変異の近くに標的とするガイドRNAが必要ですが、ヘテロ接合の導入は、距離依存性の準最適な変異の取り込みによって、または混合修復テンプレートの使用によって達成できます。このアプローチを使用して、アミロイド前駆体タンパク質（APP（SWE））およびプレセニリン1（PSEN1（M146V））および誘導性皮質ニューロンス、誘導体皮質ニューロンス、誘導体の遺伝子型において、ヘテロ接合およびホモ接合性優性アルツハイマー病の原因となる初期発症のヒト誘導多能性幹細胞を生成しました。 - 依存性疾患関連表現型。私たちの調査結果により、CRISPR/CAS9による特定のシーケンス変化の効率的な導入が可能になり、ヒト疾患の研究が促進されます。

The bacterial CRISPR/Cas9 system allows sequence-specific gene editing in many organisms and holds promise as a tool to generate models of human diseases, for example, in human pluripotent stem cells. CRISPR/Cas9 introduces targeted double-stranded breaks (DSBs) with high efficiency, which are typically repaired by non-homologous end-joining (NHEJ) resulting in nonspecific insertions, deletions or other mutations (indels). DSBs may also be repaired by homology-directed repair (HDR) using a DNA repair template, such as an introduced single-stranded oligo DNA nucleotide (ssODN), allowing knock-in of specific mutations. Although CRISPR/Cas9 is used extensively to engineer gene knockouts through NHEJ, editing by HDR remains inefficient and can be corrupted by additional indels, preventing its widespread use for modelling genetic disorders through introducing disease-associated mutations. Furthermore, targeted mutational knock-in at single alleles to model diseases caused by heterozygous mutations has not been reported. Here we describe a CRISPR/Cas9-based genome-editing framework that allows selective introduction of mono- and bi-allelic sequence changes with high efficiency and accuracy. We show that HDR accuracy is increased dramatically by incorporating silent CRISPR/Cas-blocking mutations along with pathogenic mutations, and establish a method termed 'CORRECT' for scarless genome editing. By characterizing and exploiting a stereotyped inverse relationship between a mutation's incorporation rate and its distance to the DSB, we achieve predictable control of zygosity. Homozygous introduction requires a guide RNA targeting close to the intended mutation, whereas heterozygous introduction can be accomplished by distance-dependent suboptimal mutation incorporation or by use of mixed repair templates. Using this approach, we generated human induced pluripotent stem cells with heterozygous and homozygous dominant early onset Alzheimer's disease-causing mutations in amyloid precursor protein (APP(Swe)) and presenilin 1 (PSEN1(M146V)) and derived cortical neurons, which displayed genotype-dependent disease-associated phenotypes. Our findings enable efficient introduction of specific sequence changes with CRISPR/Cas9, facilitating study of human disease.