リアルタイムPCRによる血漿サンプルの細胞自由DNAを定量化するキメラ外部コントロール

背景：DNA分離手順は、細胞を含まないDNA（CfDNA）が被験者である場合、特にリアルタイムPCRによるDNAの定量化に大きく影響する可能性があります。抽出効率、抽出収率の直線性、共精製阻害剤の存在を評価し、CFDNAに関連するフラグメントサイズの問題を回避するために、適切な外部DNA制御（EDC）の開発が困難です。非ヒトのキメラヌクレオチド配列を使用して、EDCが開発され、QPCRの標準化が時間の経過とともに血液サンプル中のCfDNA濃度の安定性を監視するために開発されました。 方法：EDCフラグメントとして指定されたパルボウイルスB19およびPBHAの167 bpキメラシーケンスのA0 DNAフラグメントが設計されました。CfDNAの定量化に対するDNA抽出処理中のさまざまな因子の影響を決定するために、血液サンプルを正常被験者から収集し、特定の治療の有無にかかわらずアリコートに分割しました。時間間隔で、血漿サンプルが分離されました。1.1 pg/500μLの最終濃度の167 bp EDCフラグメントのアンプリコンを各血漿サンプルに加え、総DNAをIN HOSEメソッドによって抽出しました。抽出されたサンプルでEDCフラグメントとCfDNAの両方を定量化するために、相対的および絶対定量化リアルタイムPCRを実行しました。 結果：特定の処理の有無にかかわらずチューブのCfDNAフラグメントのリアルタイムPCR閾値サイクル（CT）の比較は、未処理チューブの減少を示しました。対照的に、しきい値サイクルは、処理されたチューブおよび未処理のチューブのEDCフラグメントの一定であり、CfDNAのCT値の違いは、それらに作られた特定の処理によるものです。 結論：CFDNAに関連するDNAフラグメントサイズのプラズマサンプルへのスパイクは、サンプルの調製と抽出処理のためにバイアスを最小限に抑えるのに役立ちます。したがって、正確なデータ分析のために、cfDNAの抽出と定量化のために標準的な外部DNAコントロールを使用することを強くお勧めします。

BACKGROUND: DNA isolation procedure can significantly influence the quantification of DNA by real time PCR specially when cell free DNA (cfDNA) is the subject. To assess the extraction efficiency, linearity of the extraction yield, presence of co-purified inhibitors and to avoid problems with fragment size relevant to cfDNA, development of appropriate External DNA Control (EDC) is challenging. Using non-human chimeric nucleotide sequences, an EDC was developed for standardization of qPCR for monitoring stability of cfDNA concentration in blood samples over time. METHODS: A0 DNA fragment of 167 bp chimeric sequence of parvovirus B19 and pBHA designated as EDC fragment was designed. To determine the impact of different factors during DNA extraction processing on quantification of cfDNA, blood samples were collected from normal subjects and divided into aliquots with and without specific treatment. In time intervals, the plasma samples were isolated. The amplicon of 167 bp EDC fragment in final concentration of 1.1 pg/500 μl was added to each plasma sample and total DNA was extracted by an in house method. Relative and absolute quantification real time PCR was performed to quantify both EDC fragment and cfDNA in extracted samples. RESULTS: Comparison of real time PCR threshold cycle (Ct) for cfDNA fragment in tubes with and without specific treatment indicated a decrease in untreated tubes. In contrast, the threshold cycle was constant for EDC fragment in treated and untreated tubes, indicating the difference in Ct values of the cfDNA is because of specific treatments that were made on them. CONCLUSIONS: Spiking of DNA fragment size relevant to cfDNA into the plasma sample can be useful to minimize the bias due to sample preparation and extraction processing. Therefore, it is highly recommended that standard external DNA control be employed for the extraction and quantification of cfDNA for accurate data analysis.