テロメラーゼ反復増幅プロトコル（TRAP）

テロメアは真核生物の線形染色体の端に見られ、テロメアに結合するタンパク質は、DNAを二本鎖切断として認識されないように保護し、エンドツーエンドの融合を防ぎます（Griffith et al。、1999）。ただし、最終的な複製の問題や酸化的損傷などの他の要因により、培養細胞の寿命が限られている（ヘイフリック制限）により、これらの保護構造が進行して短縮されます（Hayflick and Moorhead、1961; Olovnikov、1973）。タンパク質触媒成分HTERTおよび機能性RNA成分HTRまたはHTERCのリボ核核タンパク質酵素酵素酵素複合体テロメラーゼ化装置は、原発性ヒト腫瘍の〜90％にテロメアリピートを追加し、一時的な延期された幹細胞様型において染色体の終わりにテロメアリピートを添加することにより、テロメア短縮を逆行します。セル（Shay and Wright、1996; Shay and Wright、2001）。これにより、癌の特徴である細胞が継続的に増殖します。したがって、テロメア生物学は、老化、がんの進行/転移、および標的がん療法において中心的な役割を果たしています。テロメア制限フラグメント（TRF）（Mender and Shay、2015b）、テロメアリピート増幅プロトコル（TRAP）、テロメア機能障害誘発FOCI（TIF）分析（Mender and Shay、2015a）など、テロメア生物学には一般的に使用される方法があります。この詳細なプロトコルでは、テロメアリピート増幅プロトコル（TRAP）について説明します。トラップアッセイは、哺乳類細胞と組織サンプルにおけるテロメラーゼ活性を決定するための一般的な方法です（Kim et al。、1994）。トラップアッセイには、テロメラーゼ産物の拡張、増幅、および検出の3つのステップが含まれます。拡張ステップでは、テロメラーゼ基質（実際にはテロメア語のオリゴヌクレオチド、TS）にテロメラーゼのテロメラーゼ基質に繰り返されます。増幅ステップでは、拡張産物は、特定のプライマー（TSアップストリームプライマーとACX下流プライマー）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅され、検出ステップでは、テロメラーゼの存在または不在が電気泳動によって分析されます。TSNTは、TSプライマーによって増幅された内部標準コントロールです。NTは独自のリバースプライマーであり、テロメラーゼの基質ではありません。これらのプライマーは、ゲルが内部コントロールバンドを欠いている場合、偽陰性の結果を識別するために使用されます。

Telomeres are found at the end of eukaryotic linear chromosomes, and proteins that bind to telomeres protect DNA from being recognized as double-strand breaks thus preventing end-to-end fusions (Griffith et al., 1999). However, due to the end replication problem and other factors such as oxidative damage, the limited life span of cultured cells (Hayflick limit) results in progressive shortening of these protective structures (Hayflick and Moorhead, 1961; Olovnikov, 1973). The ribonucleoprotein enzyme complex telomerase-consisting of a protein catalytic component hTERT and a functional RNA component hTR or hTERC- counteracts telomere shortening by adding telomeric repeats to the end of chromosomes in ~90% of primary human tumors and in some transiently proliferating stem-like cells (Shay and Wright, 1996; Shay and Wright, 2001). This results in continuous proliferation of cells which is a hallmark of cancer. Therefore, telomere biology has a central role in aging, cancer progression/metastasis as well as targeted cancer therapies. There are commonly used methods in telomere biology such as Telomere Restriction Fragment (TRF) (Mender and Shay, 2015b), Telomere Repeat Amplification Protocol (TRAP) and Telomere dysfunction Induced Foci (TIF) analysis (Mender and Shay, 2015a). In this detailed protocol we describe Telomere Repeat Amplification Protocol (TRAP). The TRAP assay is a popular method to determine telomerase activity in mammalian cells and tissue samples (Kim et al., 1994). The TRAP assay includes three steps: extension, amplification, and detection of telomerase products. In the extension step, telomeric repeats are added to the telomerase substrate (which is actually a non telomeric oligonucleotide, TS) by telomerase. In the amplification step, the extension products are amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using specific primers (TS upstream primer and ACX downstream primer) and in the detection step, the presence or absence of telomerase is analyzed by electrophoresis. TSNT is, an internal standard control, amplified by TS primer. NT is its own reverse primer, which is not a substrate for telomerase. These primers are used to identify false-negative results by if the gel lacks internal control bands.