ハイブリダイゼーション連鎖反応と組織ヒドロゲルの埋め込みとクリアによる深さでの単一分子RNA検出

厚い組織サンプルにおけるmRNA分子の正確で堅牢な検出は、ネイティブ環境内の単一細胞の遺伝子発現パターンを明らかにすることができます。選択された細胞のトランスクリプトームにアクセスしながら空間関係を保存することは、発達生物学から神経科学まで、多くの生物学的領域を進めるための重要な特徴です。ただし、多くの組織サンプルの自己蛍光の背景が高いため、不透明な厚いサンプルでは単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション（SMFish）が堅牢にシグナルを検出することは困難です。ここでは、動的核酸ナノテクノロジーの新たな分野からの原則を利用して、単一分子ハイブリダイゼーション連鎖反応（SMHCR）を使用して、深部組織におけるマルチカラーのマルチRNAイメージングのための堅牢な方法を開発します。このアプローチを使用して、単一の転写産物は、必要なイメージングの深さに応じて、上蛍光、共焦点または選択的平面照明顕微鏡（SPIM）を使用して画像化できます。SMHCRは、細胞培養および全マウントのゼブラフィッシュ胚のmRNAの検出において高い感度を持ち、SPIMとPACT（パッシブの透明度技術）組織ヒドロゲルの埋め込みと除去と組み合わされて、SMHCRは厚さ（0.5 mm）内の単一mRNAを検出できることを示しています。脳のスライス。〜20倍の信号増幅と回折制限空間分解能を同時に達成することにより、SMHCRは、高背景が増幅されていないSMFishの性能を損なう厚い組織を含む、その場で単一mRNAを検出するための堅牢で汎用性の高いアプローチを提供します。

Accurate and robust detection of mRNA molecules in thick tissue samples can reveal gene expression patterns in single cells within their native environment. Preserving spatial relationships while accessing the transcriptome of selected cells is a crucial feature for advancing many biological areas - from developmental biology to neuroscience. However, because of the high autofluorescence background of many tissue samples, it is difficult to detect single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) signals robustly in opaque thick samples. Here, we draw on principles from the emerging discipline of dynamic nucleic acid nanotechnology to develop a robust method for multi-color, multi-RNA imaging in deep tissues using single-molecule hybridization chain reaction (smHCR). Using this approach, single transcripts can be imaged using epifluorescence, confocal or selective plane illumination microscopy (SPIM) depending on the imaging depth required. We show that smHCR has high sensitivity in detecting mRNAs in cell culture and whole-mount zebrafish embryos, and that combined with SPIM and PACT (passive CLARITY technique) tissue hydrogel embedding and clearing, smHCR can detect single mRNAs deep within thick (0.5 mm) brain slices. By simultaneously achieving ∼20-fold signal amplification and diffraction-limited spatial resolution, smHCR offers a robust and versatile approach for detecting single mRNAs in situ, including in thick tissues where high background undermines the performance of unamplified smFISH.