馬の糞便からDNAを抽出するための修飾フェノール/クロロホルムと市販のキット法の比較

糞便サンプルから次世代シーケンス（NGS）のために細菌DNAを抽出する方法には多くの選択肢があります。ここでは、フェノール/クロロホルム抽出法の修飾と阻害剤除去溶液（C3）（PH/CHL+C3）をPowerFecal®DNA分離キット（MOBIO-K）と比較します。NGSの結果に結合されたDNAの品質と量を使用して、相対的な存在量、シャノン多様性指数、一意の種、および生物学的複製の間の原理座標分析（PCOA）の違いを評価しました。直腸から手動で収集された馬の糞の単一のボールから採取した6つの複製サンプルは、各抽出方法にさらされました。PH/CHL+C3メソッドは、MOBIO-K法よりもせん断が少ない100倍のDNA収率を生成しました。方法を評価するために、Illumina Miseqプラットフォームを使用して、16S RRNA遺伝子の細菌V3-V4領域のシーケンスのために2つの方法サンプルを送信しました。バクテロイド類の相対存在量は大きく、PH/Chl+C3よりもMobio-Kのこのグループに割り当てられたよりユニークな種がありました（P <0.05）。対照的に、しっかりした硬化は、Mobio-KよりもpH/Chl+C3抽出物の方が相対的な存在量とよりユニークな種を持っていました（P <0.05）。他の主要な細菌門は、両方の抽出方法を使用してサンプルに等しく豊富でした。アルファダイバーシティとシャノンウィーバーインデックスは、Mobio-K（P <0.05）と比較して、pH/Chl+C3の細菌分布の均一性を示しましたが、OTUの豊かさに違いはありませんでした。原理座標分析（PCOA）は、Mobio-KよりもpH/Chl+C3の2つの方法（p <0.05）とより厳しいクラスタリング（変動性の低い）の明確な分離を示しました。これらの結果は、PH/CHL+C3が、クロストリジウムやバチルスなどの特定の硬質分類群を特定するために研究に優先される可能性があることを示唆しています。しかし;Mobio-Kは、バクテロイドの豊富さに焦点を当てたプロジェクトにとってより良い選択かもしれません。PH/CHL+C3メソッドは時間を短縮する必要がありましたが、フェノールとクロロホルムの曝露と廃棄に関連する安全性の懸念があります。Mobio-Kは、ヒュームフードのような安全装置へのアクセスが少ない研究者にとってより良い選択かもしれません。

There are many choices for methods of extracting bacterial DNA for Next Generation Sequencing (NGS) from fecal samples. Here, we compare our modifications of a phenol/chloroform extraction method plus an inhibitor removal solution (C3) (ph/Chl+C3) to the PowerFecal® DNA Isolation Kit (MoBio-K). DNA quality and quantity coupled to NGS results were used to assess differences in relative abundance, Shannon diversity index, unique species, and principle coordinate analysis (PCoA) between biological replicates. Six replicate samples, taken from a single ball of horse feces manually collected from the rectum, were subjected to each extraction method. The Ph/Chl+C3 method produced 100× higher DNA yields with less shearing than the MoBio-K method. To assess the methods, the two method samples were sent for sequencing of the bacterial V3-V4 region of 16S rRNA gene using the Illumina MiSeq platform. The relative abundance of Bacteroidetes was greater and there were more unique species assigned to this group in MoBio-K than in Ph/Chl+C3 (P<0.05). In contrast, Firmicutes had greater relative abundance and more unique species in Ph/Chl+C3 extracts than in MoBio-K (P<0.05). The other major bacterial phyla were equally abundant in samples using both extraction methods. Alpha diversity and Shannon Weaver indices showed greater evenness of bacterial distribution in Ph/Chl+C3 compared with MoBio-K (P<0.05), but there was no difference in the OTU richness. Principle coordinate analysis (PCoA) indicated a distinct separation between the two methods (P<0.05) and tighter clustering (less variability) in Ph/Chl+C3 than in MoBio-K. These results suggest that the Ph/Chl+C3 may be preferred for research to identify specific Firmicutes taxa such as Clostridium, and Bacillus. However; MoBio-K may be a better choice for projects focusing on Bacteroidetes abundance. The Ph/Chl+C3 method required less time, but has some safety concerns associated with exposure and disposal of phenol and chloroform. While the MoBio-K may be better choice for researchers with less access to safety equipment like a fume hood.