大腸菌生産株におけるPBADプロモーターからの異種発現の変調

プロモーターPBADは、中程度の高発現レベル、安価で非毒性の単糖L-アラビノースによる誘導、および転写の緊密な調節などのいくつかの利点のために、異種遺伝子発現に頻繁に使用されます。これは、毒性タンパク質の発現に特に重要です。このプロモーターの欠点は、誘導誘発性濃度で発生するオールまたはノンの誘導です。細胞培養の全体的な発現レベルは、アラビノース濃度の増加と相関しているように見えますが、集団は誘導細胞と誘導細胞の混合物であり、アラビノース濃度の増加とともに、誘導細胞の割合のみが増加します。この現象は、自己触媒遺伝子発現によって引き起こされます - アラビノース輸送体の発現は、輸送された分子によって誘導されます。この研究では、アラエの発現を制御するプロモーターPEは、異種タンパク質産生に一般的に使用される2つの大腸菌株でより強力なPBADプロモーターと交換されました。この修飾は、細胞壁の基礎数のアラビノース輸送体を増加させ、誘導に必要な閾値濃度を減らし、したがって細胞集団の不均一性を低下させるはずです。個々の細胞における不均一性と発現レベルは、レポーター遺伝子としてGFPを使用してフローサイトメトリーによって分析されました。BL21AI株では、プロモーター交換により、アラビノース濃度が飽和している場合の誘導細胞の数と、飽和誘導剤濃度でのタンパク質の収率が増加しました。対照的に、変更はRV308AIでこれらの特性を改善しませんでした。両方の株で、誘導細胞の発現レベルを3〜6倍に変調することができました。

Promoter PBAD is frequently used for heterologous gene expression due to several advantages, such as moderately high expression levels, induction by an inexpensive and non-toxic monosaccharide L-arabinose and tight regulation of transcription, which is particularly important for expression of toxic proteins. A drawback of this promoter is all-or-none induction that occurs at subsaturating inducer concentrations. Although the overall expression level of the cell culture seems to correlate with increasing arabinose concentrations, the population is a mixture of induced and uninduced cells and with increasing arabinose concentrations, only the fraction of induced cells increases. This phenomenon is caused by autocatalytic gene expression - the expression of the arabinose transporter AraE is induced by the transported molecule. In this work the promoter PE, controlling the expression of araE, was exchanged for the stronger PBAD promoter in two Escherichia coli strains commonly used for heterologous protein production. This modification should increase a basal number of arabinose transporters in the cell wall and reduce the threshold concentration required for induction and thus reduce heterogeneity of cell population. Heterogeneity and level of expression in individual cells were analysed by flow cytometry using gfp as a reporter gene. In the strain BL21ai, the promoter exchange increased the number of induced cells at subsaturating arabinose concentrations as well as a yield of protein at saturating inducer concentration. In contrast, the modification did not improve these characteristics in RV308ai. In both strains it was possible to modulate the expression level in induced cells 3-6-fold even at subsaturating arabinose concentrations.