最適化されたペプチド分野マッチングおよび合理化された配列ライブラリを使用したN末端ペプチド検出

ペプチドスペクトルマッチングアルゴリズムOMSSAとマスコットを使用して、注釈付き開始部位の下流の翻訳開始部位にマッピングする酵母細胞溶解物のトリプティックペプチドを特定しました。ペプチドスペクトルマッチングの精度を高めるために、両方のアルゴリズムをいくつかの標準化されたパラメーターセットを使用して実行し、マスコットを衝突誘導解離からA、B、およびYイオンを使用して実行しました。検出されたN末端ペプチドの大部分（22％）は、注釈付き開始部位の下流の翻訳開始にマッピングされました。全長タンパク質と同じ読み取りフレームでの下流の開始からのいくつかの切り捨てられたタンパク質の発現（フレーム1）は、西洋分析によって検証されました。ショウジョウバエのより大きなプロテオームの分析を促進するために、すべての重複したトリプシンフラグメントが除去された合理化されたシーケンスライブラリを作成しました。この「剥がれた」ライブラリを使用したOMSSA評価により、171のペプチドが下流の翻訳開始部位にマッピングされていることが明らかになりました。その76％はフルレングス注釈タンパク質と同じ読み取りフレームにありますが、一部は異なる読み取りフレームにあり、新しいタンパク質シーケンスを作成しない異なる読み取りフレームにあります。注釈付きプロテオーム。下流のAUGスタートコドンを取り巻くシーケンスは、顕著な3塩基の周期性N1^G2^A3を伴うヌクレオチドの好みに関連付けられています。

We identified tryptic peptides in yeast cell lysates that map to translation initiation sites downstream of the annotated start sites using the peptide-spectrum matching algorithms OMSSA and Mascot. To increase the accuracy of peptide-spectrum matching, both algorithms were run using several standardized parameter sets, and Mascot was run utilizing a, b, and y ions from collision-induced dissociation. A large fraction (22%) of the detected N-terminal peptides mapped to translation initiation downstream of the annotated initiation sites. Expression of several truncated proteins from downstream initiation in the same reading frame as the full-length protein (frame 1) was verified by western analysis. To facilitate analysis of the larger proteome of Drosophila, we created a streamlined sequence library from which all duplicated trypsin fragments had been removed. OMSSA assessment using this "stripped" library revealed 171 peptides that map to downstream translation initiation sites, 76% of which are in the same reading frame as the full-length annotated proteins, although some are in different reading frames creating new protein sequences not in the annotated proteome. Sequences surrounding implicated downstream AUG start codons are associated with nucleotide preferences with a pronounced three-base periodicity N1^G2^A3.