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Investigative ophthalmology & visual science2016Aug01Vol.57issue(10)

培養されたヒト角膜内皮細胞の資格のためのエキソソームタンパク質およびmiRのパネルの付随的評価

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文献タイプ:
  • Journal Article
  • Research Support, Non-U.S. Gov't
概要
Abstract

目的:分泌されたmiRNAプロファイルを使用して、細胞注射療法に適応できる培養ヒト角膜内皮細胞(CHCEC)を適格にする方法を解明します。 方法:不均一亜集団(SPS)の複合材料のCHCECのバリエーションは、表面クラスターの拡散範囲(CD)マーカーに関連して検証されました。培養上清(CS)におけるマイクロRNA(miRNA)プロファイルの統合分析は、3D遺伝子ヒトマイクロRNAチップによって調査されました。3D遺伝子の結果を検証するために、定量的リアルタイムPCRは、明確な形態とSP組成の多数の培養から行われました。CSのエキソソームとmiRNAも分析されました。 結果:形態学的に二球菌CHCEC SPSの分泌miRNAプロファイルは、個々の区別に有用であることが証明されました。CD44 ++ 〜CD44 +++表現型のCD44-SPSを識別する候補miRNAは、miRS 221-3p、1246、1915-3p、および4732-5pでした。後者の3つのmiRのレベルは、コントロール培地のレベルと比較して、細胞状態遷移(CST)のないCHCEC CSで劇的に減少しましたが、老化様CSTのCHCECのレベルは増加を示しました。MicroR184は、CHCECでのCD44のアップレギュレーションと並行して反比例しました。CD9+エキソソームは、CSTのないCHCSよりも老化様CSTを使用してCHCEC CSでより上昇し、これらの細胞外小胞(EV)がCSTのないCHCECに輸入される可能性を示しています。 結論:成熟したHCECのCD44-表現型を共有する培養HCECは、CSのmiRNAまたはエキソソームの量を測定することにより識別される可能性があります。したがって、CSのmiRNAは、CHCECを修飾するツールとして機能する可能性があります。これらのEVを介した細胞間コミュニケーションの将来の詳細な分析は、HCEC培養におけるCSTをよりよく理解するための新しい経路を開く可能性があります。

目的:分泌されたmiRNAプロファイルを使用して、細胞注射療法に適応できる培養ヒト角膜内皮細胞(CHCEC)を適格にする方法を解明します。 方法:不均一亜集団(SPS)の複合材料のCHCECのバリエーションは、表面クラスターの拡散範囲(CD)マーカーに関連して検証されました。培養上清(CS)におけるマイクロRNA(miRNA)プロファイルの統合分析は、3D遺伝子ヒトマイクロRNAチップによって調査されました。3D遺伝子の結果を検証するために、定量的リアルタイムPCRは、明確な形態とSP組成の多数の培養から行われました。CSのエキソソームとmiRNAも分析されました。 結果:形態学的に二球菌CHCEC SPSの分泌miRNAプロファイルは、個々の区別に有用であることが証明されました。CD44 ++ 〜CD44 +++表現型のCD44-SPSを識別する候補miRNAは、miRS 221-3p、1246、1915-3p、および4732-5pでした。後者の3つのmiRのレベルは、コントロール培地のレベルと比較して、細胞状態遷移(CST)のないCHCEC CSで劇的に減少しましたが、老化様CSTのCHCECのレベルは増加を示しました。MicroR184は、CHCECでのCD44のアップレギュレーションと並行して反比例しました。CD9+エキソソームは、CSTのないCHCSよりも老化様CSTを使用してCHCEC CSでより上昇し、これらの細胞外小胞(EV)がCSTのないCHCECに輸入される可能性を示しています。 結論:成熟したHCECのCD44-表現型を共有する培養HCECは、CSのmiRNAまたはエキソソームの量を測定することにより識別される可能性があります。したがって、CSのmiRNAは、CHCECを修飾するツールとして機能する可能性があります。これらのEVを介した細胞間コミュニケーションの将来の詳細な分析は、HCEC培養におけるCSTをよりよく理解するための新しい経路を開く可能性があります。

PURPOSE: We elucidate a method to use secreted miRNA profiles to qualify cultured human corneal endothelial cells (cHCECs) adaptable for cell-injection therapy. METHODS: The variations of cHCECs in their composites of heterogeneous subpopulations (SPs) were verified in relation to their surface cluster-of-differentiation (CD) markers. Integrated analysis of micro RNA (miRNA) profiles in culture supernatants (CS) were investigated by 3D-Gene Human microRNA Chips. To validate 3D-Gene results, quantitative real-time PCR was done from numerous cultures with distinct morphology and SP composition. Exosomes and miRNAs in CS also were analyzed. RESULTS: Secreted miRNA profiles among morphologically-diverse cHCEC SPs proved useful for individual distinction. Candidate miRNAs to discriminate CD44- SPs from those with CD44++ ∼ CD44+++ phenotypes were miRs 221-3p, 1246, 1915-3p, and 4732-5p. The levels of the latter-three miRs decreased dramatically in cHCEC CS without cell-state transition (CST) compared to those of control medium, whereas those from cHCECs with senescence-like CST showed an increase. MicroR184 decreased inversely in parallel with the upregulation of CD44 on cHCECs. CD9+ exosomes were more elevated in cHCEC CS with senescence-like CST than those without CST, indicating the possible import of these extracellular vesicles (EVs) into cHCECs without CST. CONCLUSIONS: Cultured HCECs sharing a CD44- phenotype of matured HCECs may be discriminated by measuring the amount of miRNAs or exosome in CS. Thus, miRNA in CS may serve as a tool to qualify cHCECs. Future detailed analysis of cell-to-cell communication via these EVs might open novel pathways for a better understanding of CST in HCEC cultures.

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