レンチウイルスベクターを干渉するP66SHC遺伝子の構築と、高酸素症によって誘導される肺胞上皮細胞へのその影響アポトーシス

背景：この研究の目的は、P666SHCの発現に対するレンチウイルスベクターを干渉するp66SHC遺伝子の阻害効果を観察し、高酸素症によって誘導される肺胞上皮細胞アポトーシスに対するその効果を調査することです。 方法：遺伝子配列は、GeneBank検索によって選択されたPLENR-GPH-shRNAレンチウイルスベクターにクローニングされました。PLENR-GPH-SHRNAおよびレンチウイルスベクターパッケージングプラスミド混合は、レンチウイルス粒子をパッケージ化するために293T細胞に同時トランスフェクトされました。培養ウイルス上清を採取し、その後、ウイルス力価を連続希釈アッセイによって決定しました。A549細胞に構築されたレンチウイルスベクターと、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）とウエスタンブロットを使用してP66SHC発現を評価しました。この研究は、対照群、高酸素症グループ、A549-P66ShcshRNA高酸素群、および陰性レンチウイルス群に分けられています。細胞アポトーシスは、24時間後にフローサイトメトリーによって検出されました。アポトーシスタンパク質（XIAP）およびカスパーゼ-9のX連鎖阻害剤の発現は、免疫組織化学アッセイによって検出されました。反応性酸素種と細胞ミトコンドリア膜電位（Δψm）の産生は、蛍光顕微鏡によって決定されました。 結果：レンチウイルスベクターを干渉するP66SHC遺伝子A549-P66SHCSHRNAの確立に成功しました。A549-P66SHCSHRNAを肺胞上皮細胞にトランスフェクトし、p66SHCの発現に対する阻害効果が観察されました。RT-PCRとウエスタンブロットの両方が、A549細胞におけるP66SHC発現のダウンレギュレーションを示しました。A549-P66SHCSHRNA高酸素群では、酸化ストレスが減衰していることがわかりました。A549-P66SHCSHRNAは、P66SHC遺伝子のサイレンシングを引き起こし、ミトコンドリアの反応性酸素種の生成を減らし、膜電位の減少を減らし、A549細胞のアポトーシスを減らし、肺胞上皮細胞損傷を減らし、レンチウイルスの空のベクターグループにはそのような変化はありませんでした。 結論：P666SHC遺伝子干渉レンチウイルスベクターは、高酸素症によって誘導される肺胞上皮細胞アポトーシスに影響を与える可能性があります。

BACKGROUND: The aim of this study is to observe the inhibitive effects of p66Shc gene interfering lentivirus vectors on the expression of p66Shc, and to explore its effects on alveolar epithelial cells apoptosis induced by hyperoxia. METHODS: The gene sequences were cloned into the pLenR-GPH-shRNA lentiviral vector, which was selected by Genebank searches. The pLenR-GPH-shRNA and lentiviral vector packaging plasmid mix were cotransfected into 293T cells to package lentiviral particles. Culture virus supernatant was harvested, and then the virus titer was determined by serial dilution assay. A549 cells were transduced with the constructed lentiviral vectors, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to evaluate p66Shc expression. This study is divided into a control group, a hyperoxia group, an A549-p66ShcshRNA hyperoxia group, and a negative lentivirus group. Cell apoptosis was detected by flow cytometry after 24 hours; the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and caspase-9 were detected by immunohistochemistry assay. The production of reactive oxygen species and cellular mitochondria membrane potential (ΔΨm) were determined by fluorescence microscopy. RESULTS: We successfully established the p66Shc gene interfering lentivirus vectors, A549-p66ShcshRNA. The A549-p66ShcshRNA was transfected into alveolar epithelial cells, and the inhibitive effects on the expression of p66Shc were observed. Both RT-PCR and Western blot demonstrated downregulation of p66Shc expression in A549 cells. In the A549-p66ShcshRNA hyperoxia group, we found dampened oxidative stress. A549-p66ShcshRNA can cause p66Shc gene silencing, reduce mitochondrial reactive oxygen species generation, reduce membrane potential decrease, reduce the apoptosis of A549 cells, and reduce alveolar epithelial cell injury, while the lentiviral empty vector group had no such changes. CONCLUSION: p66Shc gene interfering lentivirus vector can affect the alveolar epithelial cells apoptosis induced by hyperoxia.