タンパク質間相互作用の親和性を決定するための細胞結合アッセイ：技術と考慮事項

2つの相互作用性タンパク質の平衡結合親和性（KD）を決定することは、タンパク質シグナル伝達と機能の生化学的研究だけでなく、改善されたタンパク質と酵素変異体の工学にも不可欠です。タンパク質結合親和性を測定するための1つの一般的な手法は、フローサイトメトリーを使用して、細胞の表面に提示されたタンパク質へのリガンド結合を分析します。ただし、細胞結合アッセイには、タンパク質間相互作用の結合親和性を正確に定量化するための特定の考慮事項が必要です。ここでは、関連する方程式と結合親和性の決定の背後にある理論を含む、細胞ベースの結合アッセイを設計する際の基本的な仮定をカバーします。さらに、均衡とリガンドの枯渇に対する結合親和性時間を測定する際の2つの主要な考慮事項について説明します。これらの条件はKDを大幅に変更する可能性があるため、それらを回避または最小化する方法が提供されます。次に、正確なKD値を導出するために使用できる酵母または哺乳類細胞の表面に表示されるタンパク質に対する直接および競合結合アッセイを実行するための詳細なプロトコルの概要を説明します。最後に、細胞ベースの結合アッセイと他のタイプの結合アッセイとの比較が提示されます。

Determining the equilibrium-binding affinity (Kd) of two interacting proteins is essential not only for the biochemical study of protein signaling and function but also for the engineering of improved protein and enzyme variants. One common technique for measuring protein-binding affinities uses flow cytometry to analyze ligand binding to proteins presented on the surface of a cell. However, cell-binding assays require specific considerations to accurately quantify the binding affinity of a protein-protein interaction. Here we will cover the basic assumptions in designing a cell-based binding assay, including the relevant equations and theory behind determining binding affinities. Further, two major considerations in measuring binding affinities-time to equilibrium and ligand depletion-will be discussed. As these conditions have the potential to greatly alter the Kd, methods through which to avoid or minimize them will be provided. We then outline detailed protocols for performing direct- and competitive-binding assays against proteins displayed on the surface of yeast or mammalian cells that can be used to derive accurate Kd values. Finally, a comparison of cell-based binding assays to other types of binding assays will be presented.