イルミナシーケンスライブラリのハイスループット定量化の手段としての融解曲線アッセイの使用

バックグラウンド。多重化されたシーケンスは、一般にイルミナなどの非常に並列の短い読み取りシーケンスプラットフォームで実行され、ライブラリ正規化の効率は出力データセットの品質に影響を与える可能性があります。いくつかのライブラリ正規化アプローチが確立されていますが、コストや処理時間の問題により、高度に多重化されたシーケンスに理想的なものはありません。方法。融解曲線アッセイの適応に基づいて、安価でハイスループットライブラリの定量化方法が開発されました。シーケンスライブラリは、Bio-Rad Laboratories CFX Connect（TM）リアルタイムPCR検出システムを使用して、アッセイにかけられました。ライブラリの量は、86〜95°Cの相対蛍光単位の還元の合計を通じて計算されました。results.PCR濃縮シーケンスライブラリは、DNAの事前培養なしにこの定量化に適しています。理想的には、後続の処理のためにライブラリから除去する必要がある短いDNA分子は、融解温度の違いに基づいて混合物の標的DNAから区別されました。融解曲線アッセイを使用して標的とする長いシーケンスの定量化結果は、既存の方法（R（2）> 0.77）からのものと相関し、MISEQシーケンス（R（2）= 0.82）から観察されたものと相関していました。ディスカッション。多重化されたシーケンスの結果は、説明された方法の正規化パフォーマンスが、最近報告された別のハイスループットビーズベースの方法であるBenusと同等であることを示唆しています。ただし、融解曲線アッセイのコストはかなり低く、他の既存の方法のコストよりも処理時間が短く、高度に多重化されたシーケンスアプリケーションに対するより大きな適合性が示唆されています。

Background. Multiplexed sequencing is commonly performed on massively parallel short-read sequencing platforms such as Illumina, and the efficiency of library normalisation can affect the quality of the output dataset. Although several library normalisation approaches have been established, none are ideal for highly multiplexed sequencing due to issues of cost and/or processing time. Methods. An inexpensive and high-throughput library quantification method has been developed, based on an adaptation of the melting curve assay. Sequencing libraries were subjected to the assay using the Bio-Rad Laboratories CFX Connect(TM) Real-Time PCR Detection System. The library quantity was calculated through summation of reduction of relative fluorescence units between 86 and 95 °C. Results.PCR-enriched sequencing libraries are suitable for this quantification without pre-purification of DNA. Short DNA molecules, which ideally should be eliminated from the library for subsequent processing, were differentiated from the target DNA in a mixture on the basis of differences in melting temperature. Quantification results for long sequences targeted using the melting curve assay were correlated with those from existing methods (R (2) > 0.77), and that observed from MiSeq sequencing (R (2) = 0.82). Discussion.The results of multiplexed sequencing suggested that the normalisation performance of the described method is equivalent to that of another recently reported high-throughput bead-based method, BeNUS. However, costs for the melting curve assay are considerably lower and processing times shorter than those of other existing methods, suggesting greater suitability for highly multiplexed sequencing applications.