Na-H交換器NHE1の細胞質ドメインのヒスチジンクラスターは、pH感受性リン脂質結合を付与し、トランスポーター活性を調節します

Na-H交換器NHE1は、正常細胞の細胞内pH（PHI）恒常性に寄与し、癌のPHIを構成的に増加させます。NHE1活性は細胞内プロトンによってアロステリックに調節されており、低PHIでの活性が大きくなりますが、pH依存性NHE1活性の分子メカニズムは不完全に分解されたままです。NHE1の2つのホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸結合部位（PI（4,5）P2）の間のC末端細胞質ドメインに位置するヒスチジン残基の進化的に保存されたクラスターは、pH依存性PI（4,5）P2を接続することを報告します。NHE1活性を結合および調節します。NHE1の野生型C末端細胞質ドメインのGST融合は、pH 7.5と比較してpH 7.0で最大PI（4,5）P2結合の増加を示しました。ただし、HISリッチクラスターのアルギニン（RXXR3）またはアラニン（AXXA3）への置換により、pH感受性結合はそれぞれプロトン化および中性ヒスジン残基を模倣し、RXXR3変異体はPI（4,5）P2を有意に大きくしました。axxa3よりも結合。細胞で発現すると、NHE1活性とPHIはNHE1-RXXR3で有意に増加し、野生型NHE1と比較してNHE1-AXXA3で減少しました。さらに、NHE1-RXXR3を発現する線維芽細胞は、野生型NHE1を発現する線維芽細胞と比較して、細胞骨格リモデリングを可能にするPHIの増加と一致して、かなり多くの収縮性アクチンフィラメントと局所癒着を有していました。これらのデータは、NHE1活性を調節するpH感受性Pi（4,5）P2結合の分子メカニズムを特定し、NHE1の近位細胞質ドメインにおける4つのヒスチジンの進化的に保存されたクラスターがプロトン修飾部位を構成する可能性があることを示唆しています。さらに、構成的に活性化されたNHE1-RXXR3変異体は、PHIの増加が細胞行動、特に癌細胞の生物学にどのように寄与するかを研究するのに役立つ新しいツールです。

The Na-H exchanger NHE1 contributes to intracellular pH (pHi) homeostasis in normal cells and the constitutively increased pHi in cancer. NHE1 activity is allosterically regulated by intracellular protons, with greater activity at lower pHi However, the molecular mechanism for pH-dependent NHE1 activity remains incompletely resolved. We report that an evolutionarily conserved cluster of histidine residues located in the C-terminal cytoplasmic domain between two phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate binding sites (PI(4,5)P2) of NHE1 confers pH-dependent PI(4,5)P2 binding and regulates NHE1 activity. A GST fusion of the wild type C-terminal cytoplasmic domain of NHE1 showed increased maximum PI(4,5)P2 binding at pH 7.0 compared with pH 7.5. However, pH-sensitive binding is abolished by substitutions of the His-rich cluster to arginine (RXXR3) or alanine (AXXA3), mimicking protonated and neutral histidine residues, respectively, and the RXXR3 mutant had significantly greater PI(4,5)P2 binding than AXXA3. When expressed in cells, NHE1 activity and pHi were significantly increased with NHE1-RXXR3 and decreased with NHE1-AXXA3 compared with wild type NHE1. Additionally, fibroblasts expressing NHE1-RXXR3 had significantly more contractile actin filaments and focal adhesions compared with fibroblasts expressing wild type NHE1, consistent with increased pHi enabling cytoskeletal remodeling. These data identify a molecular mechanism for pH-sensitive PI(4,5)P2 binding regulating NHE1 activity and suggest that the evolutionarily conserved cluster of four histidines in the proximal cytoplasmic domain of NHE1 may constitute a proton modifier site. Moreover, a constitutively activated NHE1-RXXR3 mutant is a new tool that will be useful for studying how increased pHi contributes to cell behaviors, most notably the biology of cancer cells.