USP12脱ユビキチン化酵素へのUAF1レギュレーターの保存された2段階の結合

脱ユビキチン化酵素（DUB）活性の調節は、細胞ユビキチンシグナルの適切な機能のための不可欠なステップです。UAF1はWD40リピートタンパク質であり、3つの重要なダブ、USP1、USP12、およびUSP46に結合および活性化されます。ここでは、2.8Åの解像度と2.3ÅのUAF1のUSP12-UB/UAF1複合体の結晶構造を報告します。複合体には、USP46/UAF1複合体で見られたものに類似したUAF1結合の2つの潜在的な部位があります。これらの観察された二重結合状態に沿って、USP12/UAF1複合体の溶液にはそれぞれ1：2の化学量論があり、それぞれ4nmと325nmで2段階の結合があることがここで示されます。突然変異誘発の研究では、USP12の指がUAF1と相互作用して高い親和性インターフェイスを形成することが示されています。私たちの活性化研究では、2番目のUAF1結合が活性化に影響を与えない一方で、活性化には高い親和性結合が重要であることが確認されています。それにもかかわらず、この2つのステップ結合がよく研究されているUSP12 Paralog、USP1で保存されていることを示します。我々の結果は、USP12活動の調節に不可欠なインターフェイスを強調し、USP12活性とは無関係に調節機能に重要なUAF1の保存された2番目の結合を示しています。

Regulation of deubiquitinating enzyme (DUB) activity is an essential step for proper function of cellular ubiquitin signals. UAF1 is a WD40 repeat protein, which binds and activates three important DUBs, USP1, USP12 and USP46. Here, we report the crystal structure of the USP12-Ub/UAF1 complex at a resolution of 2.8Å and of UAF1 at 2.3Å. In the complex we find two potential sites for UAF1 binding, analogous to what was seen in a USP46/UAF1 complex. In line with these observed dual binding states, we show here that USP12/UAF1 complex has 1:2 stoichiometry in solution, with a two-step binding at 4nM and 325nM respectively. Mutagenesis studies show that the fingers sub-domain of USP12 interacts with UAF1 to form the high affinity interface. Our activation studies confirm that the high affinity binding is important for activation while the second UAF1 binding does not affect activation. Nevertheless, we show that this two step binding is conserved in the well-studied USP12 paralog, USP1. Our results highlight the interfaces essential for regulation of USP12 activity and show a conserved second binding of UAF1 which could be important for regulatory functions independent of USP12 activity.