[プロテインキナーゼA阻害剤H-89は、リボソームタンパク質S6キナーゼのリン酸化を調節することにより、SP600125誘導CMK細胞のポリプリ酸化をブロックする1]

目的は、巨核球の倍数体化に対するリボソームタンパク質S6キナーゼ1（S6K1）の翻訳後修飾の調節効果を調査する。方法SP600125、C-Jun N末端キナーゼ（JNK）阻害剤、およびCAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）阻害剤であるH-89を使用して、CMK細胞を個別または組み合わせて治療しました。処理された細胞内のヨウ化プロピジウム（PI）から染色DNAを使用して、相対DNA含有量をフローサイトメトリーで検出し、次にDNA倍数体を分析しました。ラパマイシン（mTOR）下流の標的分子の重要な哺乳類標的であるリボソームタンパク質S6キナーゼ1（S6K1）の発現とリン酸化の変化は、ウエスタンブロッティングによって分析されました。H-89とS6K1とS6K1キナーゼの活性に対するH-89の効果を分析するために、分子ドッキング研究とキナーゼ活性アッセイを実施しました。結果SP600125は、CMK細胞の倍数化を時間依存的かつ用量依存的に誘導しました。同時に、Thr421/Ser424でのS6K1のリン酸化を増加させ、Thr389でのS6K1のリン酸化を減少させました。H-89は、倍数体化をブロックするだけでなく、Thr421/Ser424でのS6K1のリン酸化を減少させ、Thr389でのS6K1のリン酸化を増加させました。分子ドッキングおよびキナーゼ活性アッセイは、H-89がS6K1のATP結合部位を占有し、その活性を阻害することを示しました。顕著に、H-89とSP600125の両方がPKAの活性を阻害しました。さらに、2つの薬物は、一緒に使用するとPKAの活性をさらに阻害しました。したがって、これらのデータは、H-89が、PKAに対する阻害効果ではなく、主にS6K1リン酸化状態を変化させることにより、CMK細胞のSP600125誘導ポリプロイド化をブロックしたことを示しています。結論H-89は、S6K1リン酸化状態を調節することにより、SP600125誘導CMK細胞の倍数体化をブロックできます。

Objective To investigate the regulatory effect of post-translation modification of ribosomal protein S6 kinase 1 (S6K1) on the polyploidization of megakaryocytes. Methods SP600125, a c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor, and H-89, a cAMP-dependent protein kinase (PKA) inhibitor, were used to treat CMK cells separately or in combination. With propidium iodide (PI) to dye DNA in the treated cells, the relative DNA content was detected by flow cytometry, and then the DNA polyploidy was analyzed. The change of expression and phosphorylation of ribosomal protein S6 kinase 1 (S6K1), an important mammalian target of rapamycin (mTOR) downstream target molecule, was analyzed by Western blotting. Molecular docking study and kinase activity assay were performed to analyze the combination of H-89 with S6K1 and the effect of H-89 on the activity of S6K1 kinase. Results SP600125 induced CMK cell polyploidization in a time-dependent and dose-dependent manner. At the same time, it increased the phosphorylation of S6K1 at Thr421/Ser424 and decreased the phosphorylation of S6K1 at Thr389. H-89 not only blocked polyploidization, but also decreased the phosphorylation of S6K1 at Thr421/Ser424 and increased the phosphorylation of S6K1 at Thr389. Molecular docking and kinase activity assay showed that H-89 occupied the ATP binding sites of S6K1 and inhibited its activity. Noticeably, both H-89 and SP600125 inhibited the activity of PKA. Moreover, the two drugs further inhibited the activity of PKA when used together. Therefore, these data indicated that H-89 blocked the SP600125-induced polyploidization of CMK cells mainly by changing S6K1 phosphorylation state, rather than its inhibitory effect on PKA. Conclusion H-89 can block the polyploidization of SP600125-induced CMK cells by regulating S6K1 phosphorylation state.