SIGLEC-8誘発性の細胞内反応性酸素種の産生およびSRCファミリーキナーゼによる好酸球細胞死の調節

理論的根拠：SIGLEC-8は、その結紮が活性酸素種（ROS）の形成と細胞死を誘導するヒト好酸球に主に発現する表面受容体です。SIGLEC-8には細胞内チロシンベースのモチーフがあるため、SRCファミリーキナーゼ（SFK）がSIGLEC-8の関与によって誘発されるROS形成と細胞死に関与していると仮定しました。 方法：ヒト末梢血好酸球を精製し、抗Siglec-8モノクローナル抗体（MAB、アゴニスト）、IL-5、およびSFK薬理学的阻害剤とインキュベートしました。短期IL-5活性化細胞でのSiglec-8誘発細胞死に焦点を当て、調節壊死型細胞死をもたらしました。ROS産生は、ジヒドロルホダミン（DHR）123の標識とフローサイトメトリー、またはAmplex Redを使用した化学発光によって決定されました。SFKの活性化は、ホスホルミネックスとウエスタンブロッティングを使用して決定されました。 結果：ROS産生の細胞局在を決定するために、細胞内ROSを測定しました。エトーシス刺激（カルシウムイオノフォアA23187）は細胞外ROS（ECROS）産生をもたらしましたが、短期IL-5活性化細胞でのSIGLEC-8-Engageageは細胞内ROS（ICROS）蓄積をもたらしました。一貫して、カタラーゼによる細胞外ROSの阻害はエトーシスを阻害しましたが、IL-5偏めのSIGLEC-8誘導細胞死は阻害されませんでした。SIGLEC-8のシグナル伝達イベントを決定するために、ウエスタンブロッティングを行い、抗Siglec-8 mab±IL-5で刺激された好酸球からの溶解物のSFKリン酸化を発見しました。どのSFKが関与しているかを特定するために、ホスホルミネックスアッセイを使用し、IL-5単独で刺激された細胞と比較して、抗SIGLEC-8およびIL-5と共刺激された細胞の細胞質画分でリン酸化FGRのレベルの増加を発見しました。ROS産生および細胞死におけるSFKの関与をテストするために、SFK阻害剤PP2とダサチニブを使用しました。どちらも抗シグレック8およびIL-5共刺激によって誘導される好酸球ROS産生と細胞死を完全に阻害しました。 結論：短期IL-5活性化好酸球におけるSiglec-8の関与は、ICROSの産生とSKFのリン酸化を引き起こし、両方ともSIGLEC-8誘導細胞死の媒介に不可欠です。

RATIONALE: Siglec-8 is a surface receptor predominantly expressed on human eosinophils where its ligation induces reactive oxygen species (ROS) formation and cell death. Since Siglec-8 has intracellular tyrosine-based motifs, we hypothesized that Src family kinases (SFKs) are involved in ROS formation and cell death induced by Siglec-8 engagement. METHODS: Human peripheral blood eosinophils were purified and incubated with anti-Siglec-8 monoclonal antibodies (mAb, agonist), IL-5, and SFK pharmacological inhibitors. We focused on Siglec-8-induced cell death in short-term IL-5-activated cells leading to a regulated necrosis-type cell death. ROS production was determined by dihydrorhodamine (DHR) 123 labeling and flow cytometry, or by chemiluminescence using Amplex red. Activation of SFK was determined using phospholuminex and Western blotting. RESULTS: In order to determine cellular localization of ROS production, we measured intra and extracellular ROS. While an ETosis stimulus (calcium ionophore A23187) led to extracellular ROS (ecROS) production, Siglec-8-engagement in short-term IL-5 activated cells led to intracellular ROS (icROS) accumulation. Consistently, inhibition of extracellular ROS by catalase inhibited ETosis, but not IL-5-primed Siglec-8-induced cell death. In order to determine signaling events for Siglec-8, we performed Western blotting and found SFK phosphorylation in lysates from eosinophils stimulated with anti-Siglec-8 mAb±IL-5. In order to identify which SFKs were involved, we used the phospholuminex assay and found increased levels of phosphorylated Fgr in the cytoplasmic fraction of cells co-stimulated with anti-Siglec-8 and IL-5 for 3 hours compared with cells stimulated with IL-5 alone. To test the involvement of SFKs in ROS production and cell death, we used SFK inhibitors PP2 and dasatinib, both of which completely inhibited eosinophil ROS production and cell death induced by anti-Siglec-8 and IL-5 co-stimulation. CONCLUSION: Siglec-8 engagement in short-term IL-5-activated eosinophils causes icROS production and SKF phosphorylation, and both are essential in mediating Siglec-8-induced cell death.