コフィリン-1および細胞質トロポミオシンアイソフォームによるアクチンフィラメント代謝回転の調節

トロポミオシンとコフィリンは、アクチンのアセンブリと分解のダイナミクスを制御するアクチン結合タンパク質です。トロポミオシンアイソフォームは、コフィリン活性を阻害または強化することができますが、この多様な調節のメカニズムはよく理解されていません。この作業では、4つの細胞骨格トロポミオシンアイソフォームとコフィリン-1によるアクチンダイナミクス調節のメカニズムを、生化学的および蛍光顕微鏡アッセイを使用して研究しました。組換えトロポミオシンアイソフォームは、TPM1（TPM1.6およびTPM1.8）およびTPM3（TPM3.2およびTPM3.4）の2つの遺伝子の産物でした。TPM1.6/1.8は、TPM3.2/3.4よりも見かけの結合定数が高く、協同性が低いF-アクチンに結合しました。その結果、コフィリン-1の補助濃度は、F-アクチンからTPM3.2/3.4の50％を除去しました。対照的に、TPM1.6/1.8の50％を解離するには、アクチン上のコフィリン-1の2および5.5モル過剰が必要でした。すべてのトロポミオシンは、コフィリン-1によって逆転したアクチンの自発的重合の速度を阻害しました。TPM1の産物は、より長いフィラメントを支持し、それらをコフィリン誘発解体化から保護しました。これは、解重合を促進したTPM3に由来するアイソフォームとは対照的でした。TPM3.4は唯一のアイソフォームであり、これはコフィリン-1によるフィラメント切断の頻度を増加させました。TPM1.6/1.8は阻害されましたが、TPM3.2/3.4は、フィラメントからのローダミン - ファロイジンの放出を加速することにつながるコフィリン誘発立体構造変化を強化しました。効果は、トロポミオシンアイソフォームのさまざまなアクチンの親和性と、トロポミオシンとコフィリン-1結合の協同性を通じて実行されたと結論付けました。in vitroで得られた結果は、さまざまな細胞で以前に実証された安定または非常に動的なフィラメントにおけるトロポミオシンアイソフォームの局在化とよく一致していました。

Tropomyosin and cofilin are actin-binding proteins which control dynamics of actin assembly and disassembly. Tropomyosin isoforms can either inhibit or enhance cofilin activity, but the mechanism of this diverse regulation is not well understood. In this work mechanisms of actin dynamics regulation by four cytoskeletal tropomyosin isoforms and cofilin-1 were studied with the use of biochemical and fluorescent microscopy assays. The recombinant tropomyosin isoforms were products of two genes: TPM1 (Tpm1.6 and Tpm1.8) and TPM3 (Tpm3.2 and Tpm3.4). Tpm1.6/1.8 bound to F-actin with higher apparent binding constants and lower cooperativities than Tpm3.2/3.4. In consequence, subsaturating concentrations of cofilin-1 removed 50% of Tpm3.2/3.4 from F-actin. By contrast, 2 and 5.5 molar excess of cofilin-1 over actin was required to dissociate 50% of Tpm1.6/1.8. All tropomyosins inhibited the rate of spontaneous polymerization of actin, which was reversed by cofilin-1. Products of TPM1 favored longer filaments and protected them from cofilin-induced depolymerization. This was in contrast to the isoforms derived from TPM3, which facilitated depolymerization. Tpm3.4 was the only isoform, which increased frequency of the filament severing by cofilin-1. Tpm1.6/1.8 inhibited, but Tpm3.2/3.4 enhanced cofilin-induced conformational changes leading to accelerated release of rhodamine-phalloidin from the filament. We concluded that the effects were executed through different actin affinities of tropomyosin isoforms and cooperativities of tropomyosin and cofilin-1 binding. The results obtained in vitro were in good agreement with localization of tropomyosin isoforms in stable or highly dynamic filaments demonstrated before in various cells.