マウスの脳のタモキシフェン：タモキシフェン誘導性Cre-Loxpシステムを使用した運命マッピング研究への影響

タモキシフェン誘導性のCre-Loxpシステムは、成虫前の致死を標的とする遺伝子を克服し、特定の細胞集団を望ましい時間点で変更し、運命マッピング研究で細胞を視覚化および追跡するために広く使用されています。この研究では、すべての遺伝的運命マッピング研究では、タモキシフェンまたはその代謝産物がCNSで活動し続ける期間が不可欠であるため、タモキシフェン分解速度論に焦点を当てました。さらに、タモキシフェン投与スキームを定義し、最小の動物の死亡率とともに最大の組換え速度を可能にすることを目指しました。タモキシフェン注射と実験の開始との間の時間枠は、タモキシフェンとその代謝物の完全な分解を可能にするのに十分な大きさでなければなりません。それ以外の場合、これらの物質は望ましくない組換えを促進し、データの誤解につながる可能性があります。最適な時間ウィンドウを定義し、4-ヒドロキシタモキシフェン、N-デスメチルタモキシフェン、エンドキシフェン、ノレンドキシフェンなどのタモキシフェンとその代謝産物の完全な分解を可能にしました。in vitroでこれらの物質の生物活性を決定し、in vivoで組換えを引き起こす最も強力な代謝物4-ヒドロキシタモキシフェンの最小限の有効濃度を決定しました。この目的のために、二重トランスジェニックCSPG4-CRE/ESR1/ROSA26SORTM14（CAG-TDTOMATO）マウスの組換え率を分析しました。タモキシフェン投与は、NG2発現細胞の赤蛍光タンパク質の発現を引き起こし、液体クロマトグラフィーを使用しました。質量分析では、脳内の研究された物質の濃度を決定します。これらの物質の分解速度論を決定し、このプロセスがマウス株、動物の年齢、および投与に影響されることを明らかにしました。我々の結果は、タモキシフェンとその代謝産物が若年成人のC57BL/6Jマウスで8日以内に完全に分解され、年齢が一致したFVB/NJ雄マウスはより効果的な分解を示したことを明らかにしました。さらに、C57BL/6Jの熟成マウスは、8日以内にすべての物質を代謝することができませんでした。初期のタモキシフェン用量の低下は、すべての研究された物質の大幅に速い分解をもたらします。血液脳関門の破壊は、同側半球のタモキシフェン代謝産物の濃度の変化を引き起こしませんでした。まとめると、マウス脳のタモキシフェン代謝は年齢、ひずみ、用量依存性であり、これらの要因を実験設計で考慮すべきであることを示しました。

The tamoxifen-inducible Cre-loxP system is widely used to overcome gene targeting pre-adult lethality, to modify a specific cell population at desired time-points, and to visualize and trace cells in fate-mapping studies. In this study we focused on tamoxifen degradation kinetics, because for all genetic fate-mapping studies, the period during which tamoxifen or its metabolites remain active in the CNS, is essential. Additionally, we aimed to define the tamoxifen administration scheme, enabling the maximal recombination rate together with minimal animal mortality. The time window between tamoxifen injection and the beginning of experiments should be large enough to allow complete degradation of tamoxifen and its metabolites. Otherwise, these substances could promote an undesired recombination, leading to data misinterpretation. We defined the optimal time window, allowing the complete degradation of tamoxifen and its metabolites, such as 4-hydroxytamoxifen, N-desmethyltamoxifen, endoxifen and norendoxifen, in the mouse brain after intraperitoneal tamoxifen injection. We determined the biological activity of these substances in vitro, as well as a minimal effective concentration of the most potent metabolite 4-hydroxytamoxifen causing recombination in vivo. For this purpose, we analyzed the recombination rate in double transgenic Cspg4-cre/Esr1/ROSA26Sortm14(CAG-tdTomato) mice, in which tamoxifen administration triggers the expression of red fluorescent protein in NG2-expressing cells, and employed a liquid chromatography, coupled with mass spectrometry, to determine the concentration of studied substances in the brain. We determined the degradation kinetics of these substances, and revealed that this process is influenced by mouse strains, age of animals, and dosage. Our results revealed that tamoxifen and its metabolites were completely degraded within 8 days in young adult C57BL/6J mice, while the age-matched FVB/NJ male mice displayed more effective degradation. Moreover, aged C57BL/6J mice were unable to metabolize all substances within 8 days. The lowering of initial tamoxifen dose leads to a significantly faster degradation of all studied substances. A disruption of the blood-brain barrier caused no concentration changes of any tamoxifen metabolites in the ipsilateral hemisphere. Taken together, we showed that tamoxifen metabolism in mouse brains is age-, strain- and dose-dependent, and these factors should be taken into account in the experimental design.