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アミノペプチダーゼA（PEPA; EC 3.4.11.7）は、乳酸細菌に存在する細胞内エキソペプチダーゼです。PEPAは、ペプチドのN末端末端からグルタミル/アスパルティル残基を切断し、したがって、これらのアミノ酸の量が増加したタンパク質加水分解物の産生に適用することができます。乳酸菌株からの最初のペパは、最近公開された研究で大腸菌で組換えられ、浄化を容易にするためにC末端のhis6タグを抱いていました。HISタグが酵素の特性に影響を与える可能性があるため、非タグ付きPEPAの単純な精製方法が必要でした。驚くべきことに、ペパは5％の非常に低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿しました。沈殿ステップの場合、PEPAの純度は95％を超え、得られた活動収量は110％でした。高純度は、生化学的特性と動態調査を可能にします。その結果、最適なpH（6.0-6.5）と温度（60-65°C）は、HIS6タグが存在するペパに匹敵しました。KM値は、それぞれ1.21 mmと比較して0.79 mmがわずかに低かった。PEPAはホモドデカマーであるため、約480 kDaの高分子量があります。したがって、その後の準備サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）ステップは有望に思われました。秒後のペパは均一性に精製されました。要約すると、提示された単純な2段階の精製方法を適用して、将来の実験の性能を初めて結晶化できるようにする大量のPEPAを精製することができます。
アミノペプチダーゼA（PEPA; EC 3.4.11.7）は、乳酸細菌に存在する細胞内エキソペプチダーゼです。PEPAは、ペプチドのN末端末端からグルタミル/アスパルティル残基を切断し、したがって、これらのアミノ酸の量が増加したタンパク質加水分解物の産生に適用することができます。乳酸菌株からの最初のペパは、最近公開された研究で大腸菌で組換えられ、浄化を容易にするためにC末端のhis6タグを抱いていました。HISタグが酵素の特性に影響を与える可能性があるため、非タグ付きPEPAの単純な精製方法が必要でした。驚くべきことに、ペパは5％の非常に低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿しました。沈殿ステップの場合、PEPAの純度は95％を超え、得られた活動収量は110％でした。高純度は、生化学的特性と動態調査を可能にします。その結果、最適なpH（6.0-6.5）と温度（60-65°C）は、HIS6タグが存在するペパに匹敵しました。KM値は、それぞれ1.21 mmと比較して0.79 mmがわずかに低かった。PEPAはホモドデカマーであるため、約480 kDaの高分子量があります。したがって、その後の準備サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）ステップは有望に思われました。秒後のペパは均一性に精製されました。要約すると、提示された単純な2段階の精製方法を適用して、将来の実験の性能を初めて結晶化できるようにする大量のPEPAを精製することができます。
The aminopeptidase A (PepA; EC 3.4.11.7) is an intracellular exopeptidase present in lactic acid bacteria. The PepA cleaves glutamyl/aspartyl residues from the N-terminal end of peptides and can, therefore, be applied for the production of protein hydrolysates with an increased amount of these amino acids, which results in a savory taste (umami). The first PepA from a lactobacilli strain was recombinantly expressed in Escherichia coli in a recently published study and harbored a C-terminal His6-tag for easier purification. Due to the fact that a His-tag might influence the properties of an enzyme, a simple purification method for the non-His-tagged PepA was required. Surprisingly, the PepA precipitated at a very low ammonium sulfate concentration of 5%. Unusual for a precipitating step, the purity of PepA was over 95% and the obtained activity yield was 110%. The high purity allows biochemical characterization and kinetic investigation. As a result, the optimum pH (6.0-6.5) and temperature (60-65 °C) were comparable to the His6-tag harboring PepA; the KM value was at 0.79 mM slightly lower compared to 1.21 mM, respectively. Since PepA is a homo dodecamer, it has a high molecular mass of approximately 480 kDa. Therefore, a subsequent preparative size-exclusion chromatography (SEC) step seemed promising. The PepA after SEC was purified to homogeneity. In summary, the simple two-step purification method presented can be applied to purify high amounts of PepA that will allow the performance of experiments in the future to crystalize PepA for the first time.
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