FBXO6を介したユビキチン化とERO1Lの分解は、小胞体ストレス誘発アポトーシスを阻害します

背景/目的：FBXO6は、SKP1-CULLIN1-F-BOXタンパク質（SCF）ユビキチンE3リガーゼ複合体の基質認識成分であり、ポリユビキチン化と分解のための糖タンパク質を標的とする展開されたN-グリコプロテインのキトビオースを認識します。FBXO6が糖タンパク質を認識する方法は完全に調査されていますが、FBXO6のユビキチン化基質はほとんど不明のままです。以前は、LC/MSスペクトルによってN-グリカン依存的に相互作用する糖タンパク質を体系的に同定し、FBXO6とグリコシル化ERO1Lとの相互作用を確認しました。 方法：内因性ERO1Lと外因性FLAG-FBXO6の関係は、ウエスタンブロットによって決定されました。in vivoユビキチン化アッセイを使用して、ERO1Lの調節におけるFBXO6の直接的な効果を検出しました。CCK8とFACSアッセイの両方を使用して、治療後の細胞のアポトーシス比を決定しました。 結果：ERO1LはFBXO6のユビキチン化基質です。FBXO6は、ユビキチン化依存性経路を介してERO1Lの分解を媒介します。FBXO6の過剰発現は、ポリユビキチン化を増加させ、ERO1Lの安定性を低下させましたが、FBXO6の阻害はERO1Lの半減期を延長しました。機能的には、FBXO6がERO1Lのタンパク質レベルを調節することにより、ERストレス誘発アポトーシスを阻害することを示しています。 結論：集合的に、我々の結果は、ERO1Lの機能的E3ユビキチンリガーゼとしてFBXO6を示し、ERストレス誘発アポトーシスの阻害に重要な役割を果たす。

BACKGROUND/AIMS: FBXO6 is the substrate recognition component of a Skp1-Cullin1-F-box protein (SCF) ubiquitin E3 ligase complex, recognizing the chitobiose in unfolded N-glycoprotein to target glycoproteins for polyubiquitination and degradation. Although how FBXO6 recognizes glycoprotein has been fully investigated, the ubiquitination substrates of FBXO6 remain largely unknown. Previously, we have systematically identified the glycoproteins that interact with FBXO6 in an N-glycan dependent manner by LC/MS spectrum and confirmed the interaction between FBXO6 and glycosylated Ero1L, a protein disulfide oxidase in endoplasmic reticulum (ER). METHODS: The relationship between endogenous Ero1L and exogenous Flag-FBXO6 were determined by Western blot. In vivo ubiquitination assay was used to detect the direct effect of FBXO6 in the regulation of Ero1L. Both CCK8 and FACS assays were used to determine the apoptosis ratio of cells after treatments. RESULTS: Ero1L is a ubiquitination substrate of FBXO6. FBXO6 mediates the degradation of Ero1L through a ubiquitylation-dependent pathway. Overexpression of FBXO6 increased the polyubiquitination and decreased the stability of Ero1L, whereas inhibition of FBXO6 prolonged the half-life of Ero1L. Functionally, we show that FBXO6 inhibits ER stress-induced apoptosis by modulating the protein level of Ero1L. CONCLUSION: Collectively, our results demonstrate FBXO6 as a functional E3 ubiquitin ligase for Ero1L that plays a critical role in inhibiting ER stress-induced apoptosis.