カルシウムインテグレーターカンパリを使用した急性脳スライスのオールオプティック機能的シナプス接続マッピング

キーポイント：遺伝的にコードされた蛍光カルシウムインテグレーターカルシウム変調光誘発性比率積分器（Campari）は、シナプスおよび神経活動によって誘導されるカルシウム流入を報告しています。その蛍光は、紫色の光とカルシウムの存在下で緑から赤に変換されます。変換速度 - 活動に対する感度 - は調整可能であり、バイオレット光の強度に依存します。シナプス活動と活動電位は、独立して重要なカンパリ変換を開始できます。サブスレッショルドシナプス入力による変換のレベルは、入力の強度と相関しており、相対的なシナプス強度の光学的読み出しを可能にします。定義されたシナプス前ニューロンの光遺伝学的活性化と組み合わせると、カンパリはシナプス接続をマッピングするためのすべての光学的方法を提供します。 要約：カルシウム変調された光活性化可能なレシオメトリック積分器（Campari）は、ユーザー指定の時間窓中に活性な細胞を永久にマークすることにより、神経回路の研究を促進する遺伝的にエンコードされたカルシウム積分器です。永続的なマーキングにより、組織の大きな帯からの信号の測定と、他の構造的または機能的なラベルとの活動の容易な相関が可能になります。カンパリの潜在的な適用の1つは、シナプス後のニューロンを光遺伝学的刺激を標的とした特定の集団にラベル付けし、すべての光学的な機能的接続マッピングを引き起こすことです。ここでは、マウス急性皮質脳スライスにおけるいくつかの一般的なニューロンカルシウムシグナルに対するカンパリの反応を特徴づけました。私たちの実験は、Campariが活動電位と亜科シナプス入力の両方によって効果的に変換され、変換レベルがシナプス強度と相関していることを示しています。重要なことに、変換速度を調整できることがわかりました。これは、光強度に直線的に関連していることがわかりました。低光変換の光レベルでは、カンパリは変換率が遅いため、広いダイナミックレンジを提供します。高光レベルでは、変換はより速く、アクティビティに対してより敏感です。最後に、軸索端子の生体内の接続性を保持するex vivo急性脳スライスの機能的回路マッピングにカンパリと光遺伝学を使用しました。単一の光源を使用して、皮質のチャネルロドプシン-2発現長距離後軸（POM）視床軸端端子を刺激し、レシピエント皮質ニューロンでカンパリ変換を誘導しました。POM刺激は、層5皮質ニューロンの堅牢な光変換と層2/3ニューロンのより弱い変換を引き起こすことがわかりました。したがって、Campariは、上方および亜領域の脱分極をキャプチャするネットワーク全体の調整可能なすべての光学回路マッピングを可能にします。

KEY POINTS: The genetically encoded fluorescent calcium integrator calcium-modulated photoactivatable ratiobetric integrator (CaMPARI) reports calcium influx induced by synaptic and neural activity. Its fluorescence is converted from green to red in the presence of violet light and calcium. The rate of conversion - the sensitivity to activity - is tunable and depends on the intensity of violet light. Synaptic activity and action potentials can independently initiate significant CaMPARI conversion. The level of conversion by subthreshold synaptic inputs is correlated to the strength of input, enabling optical readout of relative synaptic strength. When combined with optogenetic activation of defined presynaptic neurons, CaMPARI provides an all-optical method to map synaptic connectivity. ABSTRACT: The calcium-modulated photoactivatable ratiometric integrator (CaMPARI) is a genetically encoded calcium integrator that facilitates the study of neural circuits by permanently marking cells active during user-specified temporal windows. Permanent marking enables measurement of signals from large swathes of tissue and easy correlation of activity with other structural or functional labels. One potential application of CaMPARI is labelling neurons postsynaptic to specific populations targeted for optogenetic stimulation, giving rise to all-optical functional connectivity mapping. Here, we characterized the response of CaMPARI to several common types of neuronal calcium signals in mouse acute cortical brain slices. Our experiments show that CaMPARI is effectively converted by both action potentials and subthreshold synaptic inputs, and that conversion level is correlated to synaptic strength. Importantly, we found that conversion rate can be tuned: it is linearly related to light intensity. At low photoconversion light levels CaMPARI offers a wide dynamic range due to slower conversion rate; at high light levels conversion is more rapid and more sensitive to activity. Finally, we employed CaMPARI and optogenetics for functional circuit mapping in ex vivo acute brain slices, which preserve in vivo-like connectivity of axon terminals. With a single light source, we stimulated channelrhodopsin-2-expressing long-range posteromedial (POm) thalamic axon terminals in cortex and induced CaMPARI conversion in recipient cortical neurons. We found that POm stimulation triggers robust photoconversion of layer 5 cortical neurons and weaker conversion of layer 2/3 neurons. Thus, CaMPARI enables network-wide, tunable, all-optical functional circuit mapping that captures supra- and subthreshold depolarization.