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カルモジュリンベースの遺伝的エンコードされた蛍光カルシウム指標（GCAMP-S）は、細胞から自由に動く動物へのカルシウムダイナミクスを画像化する強力なツールです。しかし、速い速度論を伴う高親和性指標は、カルシウムトランジェントの時間的プロファイルを歪めます。ここでは、GCAMP6SおよびGCAMP6Fのアフィニティ超高速バリアントの低下の開発を報告します。GCAMP-Sには、RS20ペプチドとカルシウムカルモジュリンの相互作用に速度制限プロセスを伴う共通の運動メカニズムがあると仮定しました。したがって、GCAMP6FUを生成する合理的な設計により、in vitroで蛍光上昇と減衰時間（T1/2）がそれぞれGCAMP6Fよりも9および22倍高速であることを生成する合理的設計により、結合界面内の特定の残基を標的としました。。HEK293T細胞では、GCAMP6FUは、GCAMP6FよりもATP誘発細胞内カルシウムトランジェントの4倍の速い減衰を明らかにしました。100 Hzで発射された5つの活動電位を持つ海馬CA1ピラミッドニューロンの刺激により、単一の樹状カルシウム過渡が発生し、GCAMP6Fよりも2倍の速い上昇と7倍の減衰時間（T1/2の40ミリ秒）が得られ、その追跡が高いことを示しています。周波数活動電位は、カルシウムダイナミクスによって制限される場合があります。GCAMP6FUの生成に使用される設計戦略は、GCAMP型カルシウムインジケーターの応答速度の加速に適用できることを提案します。
カルモジュリンベースの遺伝的エンコードされた蛍光カルシウム指標（GCAMP-S）は、細胞から自由に動く動物へのカルシウムダイナミクスを画像化する強力なツールです。しかし、速い速度論を伴う高親和性指標は、カルシウムトランジェントの時間的プロファイルを歪めます。ここでは、GCAMP6SおよびGCAMP6Fのアフィニティ超高速バリアントの低下の開発を報告します。GCAMP-Sには、RS20ペプチドとカルシウムカルモジュリンの相互作用に速度制限プロセスを伴う共通の運動メカニズムがあると仮定しました。したがって、GCAMP6FUを生成する合理的な設計により、in vitroで蛍光上昇と減衰時間（T1/2）がそれぞれGCAMP6Fよりも9および22倍高速であることを生成する合理的設計により、結合界面内の特定の残基を標的としました。。HEK293T細胞では、GCAMP6FUは、GCAMP6FよりもATP誘発細胞内カルシウムトランジェントの4倍の速い減衰を明らかにしました。100 Hzで発射された5つの活動電位を持つ海馬CA1ピラミッドニューロンの刺激により、単一の樹状カルシウム過渡が発生し、GCAMP6Fよりも2倍の速い上昇と7倍の減衰時間（T1/2の40ミリ秒）が得られ、その追跡が高いことを示しています。周波数活動電位は、カルシウムダイナミクスによって制限される場合があります。GCAMP6FUの生成に使用される設計戦略は、GCAMP型カルシウムインジケーターの応答速度の加速に適用できることを提案します。
Calmodulin-based genetically encoded fluorescent calcium indicators (GCaMP-s) are powerful tools of imaging calcium dynamics from cells to freely moving animals. High affinity indicators with slow kinetics however distort the temporal profile of calcium transients. Here we report the development of reduced affinity ultrafast variants of GCaMP6s and GCaMP6f. We hypothesized that GCaMP-s have a common kinetic mechanism with a rate-limiting process in the interaction of the RS20 peptide and calcium-calmodulin. Therefore we targeted specific residues in the binding interface by rational design generating improved indicators with GCaMP6fu displaying fluorescence rise and decay times (t1/2) of 1 and 3 ms (37 °C) in vitro, 9 and 22-fold faster than GCaMP6f respectively. In HEK293T cells, GCaMP6fu revealed a 4-fold faster decay of ATP-evoked intracellular calcium transients than GCaMP6f. Stimulation of hippocampal CA1 pyramidal neurons with five action potentials fired at 100 Hz resulted in a single dendritic calcium transient with a 2-fold faster rise and 7-fold faster decay time (t1/2 of 40 ms) than GCaMP6f, indicating that tracking high frequency action potentials may be limited by calcium dynamics. We propose that the design strategy used for generating GCaMP6fu is applicable for the acceleration of the response kinetics of GCaMP-type calcium indicators.
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