オフターゲットですが、一時的なトランスフェクションアッセイにおけるプロモーターレポーターのシーケンス固有のshRNA関連トランスクローターのトランス活性化

一時的なトランスフェクションプロモーターレポーターアッセイは、転写調節の研究で一般的に使用されており、CIS作用の調節シーケンスとトランス作動因子の両方を定義および特性化するために使用できます。ロドプシン（RHO）プロモーターの調節を研究するために設計されたさまざまなレポーターアッセイを使用するプロセスでは、ロドプシンプロモーター駆動型レポーター発現が遺伝子ターゲットに依存しないがshRNA配列固有の特定のSHRNAによって活性化され、特定のshRNA関連の経路の関与を示唆することを発見しました。興味深いことに、ロドプシンプロモーター活性のshRNAを介した増加は、ロドプシン転写調節因子CRXおよびNRLによって相乗的に強化されました。さらに、効果は細胞株依存性であり、この経路には細胞型固有の因子の発現が必要であることを示唆しています。MicroRNA（miRNA）およびインターフェロン応答を介したプロセスは、RNAIオフターゲット現象に関与しているため、SHRNAを標的とするが、Rhoレポーターの発現を特定するためにRhoレポーター発現にさまざまな効果を持つSHRNAをトランスフェクトした細胞でmiRNAおよび遺伝子発現プロファイリングを実行しました。合計50のmiRNA種を特定し、マイクロアレイ分析、320のタンパク質コード遺伝子を特定しました。そのうちのいくつかは特定された差次的に発現したmiRNAの標的を予測しました。ターゲットオフターゲット効果に関する以前の研究と一致して、多くのインターフェロン応答遺伝子がアップレギュレートされていることが確認された遺伝子の中にありました。まとめると、RNAI実験からのデータを解釈する際のオフターゲット効果を考慮することの重要性を確認し、過渡的トランスフェクションベースの転写アッセイに対するSHRNAの効果の設計と分析に複数の慎重に設計されたコントロールを含めることの重要性に焦点を当てることにより、以前の結果を拡張します。

Transient transfection promoter reporter assays are commonly used in the study of transcriptional regulation, and can be used to define and characterize both cis-acting regulatory sequences and trans-acting factors. In the process of using a variety of reporter assays designed to study regulation of the rhodopsin (rho) promoter, we discovered that rhodopsin promoter-driven reporter expression could be activated by certain species of shRNA in a gene-target-independent but shRNA sequence-specific manner, suggesting involvement of a specific shRNA associated pathway. Interestingly, the shRNA-mediated increase of rhodopsin promoter activity was synergistically enhanced by the rhodopsin transcriptional regulators CRX and NRL. Additionally, the effect was cell line-dependent, suggesting that this pathway requires the expression of cell-type specific factors. Since microRNA (miRNA) and interferon response-mediated processes have been implicated in RNAi off-target phenomena, we performed miRNA and gene expression profiling on cells transfected with shRNAs that do target a specific gene but have varied effects on rho reporter expression in order to identify transcripts whose expression levels are associated with shRNA induced rhodopsin promoter reporter activity. We identified a total of 50 miRNA species, and by microarray analysis, 320 protein-coding genes, some of which were predicted targets of the identified differentially expressed miRNAs, whose expression was altered in the presence of shRNAs that stimulated rhodopsin-promoter activity in a non-gene-targeting manner. Consistent with earlier studies on shRNA off-target effects, a number of interferon response genes were among those identified to be upregulated. Taken together, our results confirm the importance of considering off-target effects when interpreting data from RNAi experiments and extend prior results by focusing on the importance of including multiple and carefully designed controls in the design and analysis of the effects of shRNA on transient transfection-based transcriptional assays.