マイコプラズマP37タンパク質上のマイコプラズマ中和エピトープのマッピング

多くの研究では、マイコプラマ膜タンパク質P37が癌細胞の移動、浸潤、および転移を促進することが示されています。以前は、マイコプラズマタンパク質P37に対して6つのモノクローナル抗体（mAB）を生成し、6つのMABの1つであるCa27を使用して、肝細胞癌患者の血液中のマイコプラズマ感染循環腫瘍細胞の存在を示しました。Ca27の存在下でマイコプラズマを癌細胞とインキュベートした場合、マイコプラズマ感染は完全に阻害され、Ca27がマイコプラズマ感染を阻害する中和抗体であることを示唆しています。Ca27の中和エピトープを調べるために、P37が部分的に削除された一連のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合P37欠失変異タンパク質を生成しました。E.coliでp37コーディング配列を発現するために、マイコプラズマTGAコドンをP37欠失変異体遺伝子にTGGに置き換えました。次に、GST融合P37欠失変異タンパク質をスクリーニングして、Ca27が標的とするエピトープを特定しました。ウエスタンブロットは、P37タンパク質の中央部分の残基２１６２４６に結合しているが、残基１８３２１９および２１６２０に結合しなかった。細かいマッピングにより、Ca27は残基226-246に結合できることが示されましたが、その結合活性は残基216-246と比較して比較的弱くなり、残基226-246がCa27の最適結合活性に不可欠であることを示唆しています。興味深いことに、精製されたGSTタグ付きエピトープの尿素による治​​療は、エピトープへのCa27結合がドデシル硫酸ナトリウム耐性であるが尿素感受性であることを示しました。同じ226-246残基も、他の2つの抗P37 mAbによって認識され、エピトープが免疫誘発性であることを示唆しています。新規中和エピトープの同定は、p37タンパク質と宿主受容体の間の相互作用に関する新しい洞察を提供する可能性があります。

Many studies have shown that the mycoplasmal membrane protein p37 enhances cancer cell migration, invasion, and metastasis. Previously, we generated 6 monoclonal antibodies (MAbs) against the mycoplasmal protein p37 and showed the presence of mycoplasma-infected circulating tumor cells in the blood of hepatocellular carcinoma patients by using CA27, one of the six MAbs. When mycoplasmas were incubated with cancer cells in the presence of CA27, mycoplasma infection was completely inhibited, suggesting that CA27 is a neutralizing antibody inhibiting mycoplasma infection. To examine the neutralizing epitope of CA27, we generated a series of glutathione S-transferase (GST)-fused p37 deletion mutant proteins in which p37 was partly deleted. To express p37-coding sequences in E.coli, mycoplasmal TGA codons were substituted with TGG in the p37 deletion mutant genes. GST-fused p37 deletion mutant proteins were then screened to identify the epitope targeted by CA27. Western blots showed that CA27 bound to the residues 216-246 on the middle part of the p37 protein while it did not bind to the residues 183-219 and 216-240. Fine mapping showed that CA27 was able to bind to the residues 226-246, but its binding activity was relatively weakened as compared to that to the residues 216-246, suggesting that the residues 226-246 is essential for optimal binding activity of CA27. Interestingly, the treatment of the purified GST-tagged epitopes with urea showed that CA27 binding to the epitope was sodium dodecyl sulfate-resistant but urea-sensitive. The same 226-246 residues were also recognized by two other anti-p37 MAbs, suggesting that the epitope is immunodominant. The identification of the novel neutralizing epitope may provide new insight into the interaction between the p37 protein and host receptors.