エンドヌクレアーゼを介した複数のプライマー様ローリングサークル増幅を使用したNickingを使用したDNAメチルトランスフェラーゼの敏感な蛍光検出

DNAメチルトランスフェラーゼ（MTase）の敏感で信頼できる検出は、早期腫瘍診断と治療の両方にとって非常に重要です。この研究では、シンプルでラベルフリーで敏感なDNA MTaseセンシング法が、ニックエンドヌクレアーゼを介した複数のプライマー様ローリングサークル増幅（RCA）戦略に基づいて開発されました。この方法では、ヘアピンDNAの2つの分子の鈍い端部の結紮により、ダンベルRCAテンプレートが調製されました。プライマー結合シーケンスに加えて、Dumbbellテンプレートには、二本鎖ステムの5'-CCGG-3 'シーケンス、ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位、および単一鎖ループのCリッチ配列の別の3つの重要な部分が含まれていました。5'-CCGG-3 'シーケンスの導入により、Dumbbellテンプレートは制限エンドヌクレアーゼであるHPAIIによって破壊されますが、ターゲットMTase-M.SSSSI MTaseの存在下では破壊されません。ニッキングエンドヌクレアーゼ認識部位の導入により、M.SSSI MTase保護されたDumbbellテンプレート媒介RCAが複数のプライマー様指数モードで進行するため、RCAに高い増幅効率を提供します。Cリッチシーケンスの導入により、増幅産物の折りたたみがg-quadruplex構造への折り畳みを促進する可能性があります。これは、市販の蛍光プローブチオフラビンTによって特異的に認識されます。RCA増幅効率の改善とRCA製品の特異的蛍光認識により、M.SSSI MTaseセンシングプラットフォームが高感度を備えています。4つのニックキーキングエンドヌクレアーゼ部位を含むダンベルテンプレートを使用すると、0.0011U/mlという低い検出限界で、0.008-50U/mLの範囲で非常に特異的なM.SSSI MTaseアクティビティ検出を実現できます。簡単な実験操作と混合および検出蛍光センシングモードにより、M.SSSI MTaseの定量がリアルタイムRCAモードでうまく機能することを保証し、センシングパフォーマンスをさらに簡素化し、スループットの高い検出を可能にします。提案されたMTaseセンシング戦略は、MTase阻害剤の阻害活性のスクリーニングと評価にも適用できることが実証されました。

Sensitive and reliable detection of DNA methyltransferase (MTase) is of great significance for both early tumor diagnosis and therapy. In this study, a simple, label-free and sensitive DNA MTase-sensing method was developed on the basis of a nicking endonuclease-mediated multiple primers-like rolling circle amplification (RCA) strategy. In this method, a dumbbell RCA template was prepared by blunt-end ligation of two molecules of hairpin DNA. In addition to the primer-binding sequence, the dumbbell template contained another three important parts: 5'-CCGG-3' sequences in double-stranded stems, nicking endonuclease recognition sites and C-rich sequences in single-stranded loops. The introduction of 5'-CCGG-3' sequences allows the dumbbell template to be destroyed by the restriction endonuclease, HpaII, but is not destroyed in the presence of the target MTase-M.SssI MTase. The introduction of nicking endonuclease recognition sites makes the M.SssI MTase-protected dumbbell template-mediated RCA proceed in a multiple primers-like exponential mode, thus providing the RCA with high amplification efficiency. The introduction of C-rich sequences may promote the folding of amplification products into a G-quadruplex structure, which is specifically recognized by the commercially available fluorescent probe thioflavin T. Improved RCA amplification efficiency and specific fluorescent recognition of RCA products provide the M.SssI MTase-sensing platform with high sensitivity. When a dumbbell template containing four nicking endonuclease sites is used, highly specific M.SssI MTase activity detection can be achieved in the range of 0.008-50U/mL with a detection limit as low as 0.0011U/mL. Simple experimental operation and mix-and-detection fluorescent sensing mode ensures that M.SssI MTase quantitation works well in a real-time RCA mode, thus further simplifying the sensing performance and making high throughput detection possible. The proposed MTase-sensing strategy was also demonstrated to be applicable for screening and evaluating the inhibitory activity of MTase inhibitors.