オリゴマー化は、ボウマンバーク阻害剤とプロテアーゼとの相互作用の動態と熱力学に影響を与えます

以前に光散乱と原子間力顕微鏡によって実証されたように、黒眼のエンドウトリプシン/キモトリプシン阻害剤（BTCI）は、濃度依存性ホモマルチマーを形成します。これらの自己凝集が同族酵素への結合に影響を与える可能性があることを考慮して、表面固定化キモトリプシン（α-CT）および表面プラズモン共鳴によるトリプシン（T）を使用したピコモル濃度でのBTCIの相互作用を調査しました。我々の結果は、BTCIが両方の固定化された酵素に対して亜球下親和性を持っていることを示しています。これは、以前に報告されたよりも約2桁高いです。さらに、それらの相互作用エネルギーを調査するために、タンパク質結合平衡に対する温度の影響を調査しました。BTCI/T相互作用は、セリンプロテイナーゼとのBBI相互作用について説明されている標準エントロピー駆動型メカニズムと一致していますが、BTCI/α-CT相互作用はそうではありません。私たちの測定は、双葉BTCI/α-CT複合体が負のエンタルピー変化と中程度のエントロピー増加とともに形成されることを示しています。直接熱量評価は、SPRによって得られたVan't Hoff近似と一致しています。タンパク質濃度がマイクロモル範囲に増加すると、二次的な吸熱イベントが一般的になり、タンパク質関連の動力学と熱力学の両方に影響することを実証します。私たちの研究は、セリンプロテイナーゼとのBBI相互作用を希釈溶液で研究する必要があることを強化し、しばしば無視された二次相互作用を除去する必要があります。

The black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor (BTCI) forms concentration dependent homomultimers, as previously demonstrated by Light scattering and Atomic Force Microscopy. Considering that these self-aggregates might influence their binding to cognate enzymes, we investigated the interaction of BTCI at picomolar concentrations using surface immobilized Chymotrypsin (α-CT) and Trypsin (T) by Surface Plasmon Resonance. Our results indicate that BTCI has subnanomolar affinity to both immobilized enzymes, which is approximately two orders of magnitude higher than previously reported. Moreover, we probed the influence of temperature on protein binding equilibria in order to investigate their interaction energetics. While the BTCI/T interaction concurs with the canonical entropy-driven mechanism described for BBI interactions with serine proteinases, the BTCI/α-CT interaction does not. Our measurements indicate that bimolecular BTCI/α-CT complexes form with a negative enthalpy change and a moderate entropic increase. Direct calorimetric evaluation is in accord with the van't Hoff approximation obtained by SPR. We demonstrate that as protein concentrations increase to the micromolar range, secondary endothermic events become prevalent and affect both the kinetics and thermodynamics of protein associations. Our study reinforces that BBI interactions with serine proteinases should be studied in dilute solutions to abridge often neglected secondary interactions.