Pngase Aによる酸性pHでのN結合グリコシル化の除去は、N結合糖タンパク質の水素/重水素交換量分析分析を促進します

タンパク質グリコシル化は、最も頻繁な翻訳後修飾であり、真核生物タンパク質の50％以上に存在します。グリコシル化は、多くのタイプの複雑なオリゴ糖構造を含む幅広い修飾をカバーし、糖タンパク質とそのグリカンの構造分析を、ほとんどの分析技術に挑戦します。質量分析により監視されている水素/重水素交換は、溶液中の複雑な不均一タンパク質のタンパク質立体構造ダイナミクスを調査するための敏感な手法です。しかし、N結合糖タンパク質は、HDX-MSにとって課題となります。HDX情報は、通常、ペプシン消化と組み合わせたグリカンの不均一性として実際のN結合グリカンを含む糖タンパク質の領域から取得できません。ここでは、HDXクエンチ条件、つまり酸性のpHおよび低温での標識された消化性n結合糖ペプチドの脱グリコシル化のために酵素pngase Aを利用するN結合糖タンパク質の立体構造ダイナミクスの分析のための新しいHDX-MSワークフローを紹介します。したがって、Pngase Aベースの脱グリコシル化は、標識後に行われ（HDX後）、このアプローチの有用性は、天然の立体構造ダイナミクスがN結合グリカンに依存していることが示されているモノクローナル抗体トラスツズマブの分析中に実証されています。要約すると、統合されたpngase a geglycosylationを備えたHDX-MSワークフローは、N結合グリカン部位を含むタンパク質領域の天然HDXの分析を可能にするため、グリコプラテインの立体構造特性を研究する能力を大幅に改善する必要があります。

Protein glycosylation is the most frequent post-translational modification and is present on more than 50% of eukaryotic proteins. Glycosylation covers a wide subset of modifications involving many types of complex oligosaccharide structures, making structural analysis of glycoproteins and their glycans challenging for most analytical techniques. Hydrogen/deuterium exchange monitored by mass spectrometry is a sensitive technique for investigation of protein conformational dynamics of complex heterogeneous proteins in solution. N-linked glycoproteins however pose a challenge for HDX-MS. HDX information can typically not be obtained from regions of the glycoprotein that contain the actual N-linked glycan as glycan heterogeneity combined with pepsin digestion yields a large diversity of peptic N-glycosylated peptides that can be difficult to detect. Here, we present a novel HDX-MS workflow for analysis of the conformational dynamics of N-linked glycoproteins that utilizes the enzyme PNGase A for deglycosylation of labeled peptic N-linked glycopeptides at HDX quench conditions, i.e., acidic pH and low temperature. PNGase A-based deglycosylation is thus performed after labeling (post-HDX) and the utility of this approach is demonstrated during analysis of the monoclonal antibody Trastuzumab for which it has been shown that the native conformational dynamics is dependent on the N-linked glycan. In summary, the HDX-MS workflow with integrated PNGase A deglycosylation enables analysis of the native HDX of protein regions containing N-linked glycan sites and should thus significantly improve our ability to study the conformational properties of glycoproteins.