マイコバクテリウム結核を診断するための高度に保存されたHSP65特異的ネストされたPCRプライマーの評価

目的：高度に保存された熱ショックタンパク質遺伝子を標的とする結核菌複合体の検出のために設計されたプライマーの新しいネストされたセットの感度と特異性を評価する。 設計：ネストされたプライマーは、M。tuberculosisH37RV Hsp65ゲノムのヌクレオチド配列を塩基として仮定して、複数の配列アラインメントを使用して設計されました。結核菌HSP65遺伝子特異的プライマーの特異性を評価するために、多剤耐性マイコバクテリウム種と他の非マイコバクテリアおよび真菌種が含まれています。 結果：プライマーの感度は、シリアル10倍希釈を使用して決定され、M。tuberculosis複合体の場合のバンドが示すように100％でした。他の非結核複合体細菌および真菌種のいずれも、ネストされたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の帯域を生成しませんでした。増幅の最初のラウンドでは、テンプレートDNAの0.3 ngを増幅することができ、ネストされたPCRは0.3 pgを検出できます。 結論：現在のHSP65特異的プライマーは、生化学試験、リアルタイムPCR、シーケンス、または高性能液体クロマトグラフィーの解釈を必要とせずに、敏感で、特異的で費用対効果が高いことが観察されています。これらのプライマーセットには、挿入シーケンス6110、16S RDNA、RPOB、RECA、MPT 64をターゲットにするプロトコルに関連付けられた欠点はありません。

OBJECTIVE: To evaluate the sensitivity and specificity of a new nested set of primers designed for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex targeting a highly conserved heat shock protein gene (hsp65). DESIGN: The nested primers were designed using multiple sequence alignment assuming the nucleotide sequence of the M. tuberculosis H37Rv hsp65 genome as base. Multidrug-resistant Mycobacterium species along with other non-mycobacterial and fungal species were included to evaluate the specificity of M. tuberculosis hsp65 gene-specific primers. RESULTS: The sensitivity of the primers was determined using serial 10-fold dilutions, and was 100% as shown by the bands in the case of M. tuberculosis complex. None of the other non M. tuberculosis complex bacterial and fungal species yielded any band on nested polymerase chain reaction (PCR). The first round of amplification could amplify 0.3 ng of the template DNA, while nested PCR could detect 0.3 pg. CONCLUSION: The present hsp65-specific primers have been observed to be sensitive, specific and cost-effective, without requiring interpretation of biochemical tests, real-time PCR, sequencing or high-performance liquid chromatography. These primer sets do not have the drawbacks associated with those protocols that target insertion sequence 6110, 16S rDNA, rpoB, recA and MPT 64.