ピラニンの蛍光を使用したBALB/C-3T3細胞の細胞内pHの測定

精度と感度の観点から、細胞内pHを正確に測定するために、細胞内に閉じ込められたpH依存性蛍光プローブが適切です。これらのプローブは、一般にエステル化された形で生細胞に導入され、遊離酸が酵素加水分解によって生成されます。エステルと遊離酸の蛍光特性は著しく異なり、スペクトルの不確実性が発生する可能性があります。ここでは、BALB/C-3T3マウス細胞にスクレイプされた8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（ピラニン）を使用した細胞内PHの測定について説明します。ピラニンの励起スペクトルはpH感受性であり、等筋帯は415 nm、ピークは405および465 nmで、それぞれpHとともに減少および増加します。465/405比はpHを監視するために使用できますが、415 nmの蛍光は残っている総色素依存信号を示します。スクレイプ充填染料は、最大6時間の期間細胞内で持続します。ナイジェリシン/高K+を使用してこの染料をin situで較正しましたが、in vitroで7.68と比較して、染料のPKAが7.82であることがわかりました。細胞は、急性アルカリ性または酸性負荷のいずれかを提示すると、細胞内pHをゆっくりとコントロールレベルにゆっくりと平衡化できることが観察されました。

In terms of accuracy and sensitivity, intracellularly trapped, pH-dependent fluorescent probes are appropriate to accurately measure intracellular pH. These probes are commonly introduced into living cells in esterified form, wherein the free acid is produced through enzymatic hydrolysis. The fluorescence characteristics of the ester and the free acid can differ markedly and spectral uncertainty can occur. We describe here the measurement of intracellular pH using 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (pyranine) that has been scrape-loaded into BALB/c-3T3 mouse cells. The excitation spectrum of pyranine is pH sensitive, with an isosbestic point at 415 nm and peaks at 405 and 465 nm which decrease and increase with pH, respectively. The 465/405 ratio can be used to monitor the pH, while the fluorescence at 415 nm indicates the total dye-dependent signal remaining. The scrape-loaded dye persists in cells for periods up to 6 h. We have calibrated this dye in situ using nigericin/high K+, and have found that the pKa of the dye in situ is 7.82, as compared to 7.68 in vitro. We have observed that the cells can slowly equilibrate their intracellular pH to near control levels when presented with either an acute alkaline or acid load.