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モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素（MGAT1、MGAT2、およびMGAT3）は、モノアシルグリセロールをジアシルグリセロール（DAG）に変換します。MGAT1とMGAT2はどちらも肥満関連の代謝疾患に関係しています。従来のMGAT酵素アッセイは、放射性基質を使用します。これにより、MGAT触媒反応の産物は通常、時間のかかる薄層クロマトグラフィー（TLC）分析によって解決されます。さらに、ミクロソーム膜調製物は通常、宿主細胞から内因性ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）を含み、これらのDGAT活性はDAGをさらにアシル化してトリグリセリド（TG）を形成することができます。我々の質量分析（液体クロマトグラフィータンデム質量分析、またはLC/MS/MS）MGAT2アッセイは、1-デカノイル-RAC-グリセロールとデカノイル-CoAからのディデカノイル - グリセロールのヒト組換えMGAT2触媒形成を測定し、主に1,33-didecanoyl-glycerol。1,2-Dagとは異なり、1,3-ジデカノイル - グリセロールは、Tgへのさらなるアシル化の影響を受けにくいことが証明されています。1,3-ジデカノイル - グリセロール産物は、容易に可溶化し、384ウェル形式でさらに抽出することなく、高スループット質量分析（HTMS）を直接溶解することができます。また、さまざまな種の腸内ミクロソームでLC/MS/MS MGAT活性アッセイを確立しました。私たちのアッセイは非常に敏感であることが証明されているため、細胞溶解物と組織調製物における内因性MGAT活性の測定が可能になります。HTMS MGAT活性アッセイの実装により、代謝疾患の治療のためのMGAT阻害剤の堅牢なスクリーニングと評価が促進されました。
モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素（MGAT1、MGAT2、およびMGAT3）は、モノアシルグリセロールをジアシルグリセロール（DAG）に変換します。MGAT1とMGAT2はどちらも肥満関連の代謝疾患に関係しています。従来のMGAT酵素アッセイは、放射性基質を使用します。これにより、MGAT触媒反応の産物は通常、時間のかかる薄層クロマトグラフィー（TLC）分析によって解決されます。さらに、ミクロソーム膜調製物は通常、宿主細胞から内因性ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DGAT）を含み、これらのDGAT活性はDAGをさらにアシル化してトリグリセリド（TG）を形成することができます。我々の質量分析（液体クロマトグラフィータンデム質量分析、またはLC/MS/MS）MGAT2アッセイは、1-デカノイル-RAC-グリセロールとデカノイル-CoAからのディデカノイル - グリセロールのヒト組換えMGAT2触媒形成を測定し、主に1,33-didecanoyl-glycerol。1,2-Dagとは異なり、1,3-ジデカノイル - グリセロールは、Tgへのさらなるアシル化の影響を受けにくいことが証明されています。1,3-ジデカノイル - グリセロール産物は、容易に可溶化し、384ウェル形式でさらに抽出することなく、高スループット質量分析（HTMS）を直接溶解することができます。また、さまざまな種の腸内ミクロソームでLC/MS/MS MGAT活性アッセイを確立しました。私たちのアッセイは非常に敏感であることが証明されているため、細胞溶解物と組織調製物における内因性MGAT活性の測定が可能になります。HTMS MGAT活性アッセイの実装により、代謝疾患の治療のためのMGAT阻害剤の堅牢なスクリーニングと評価が促進されました。
Monoacylglycerol acyltransferase enzymes (MGAT1, MGAT2, and MGAT3) convert monoacylglycerol to diacylglycerol (DAG). MGAT1 and MGAT2 are both implicated in obesity-related metabolic diseases. Conventional MGAT enzyme assays use radioactive substrates, wherein the product of the MGAT-catalyzed reaction is usually resolved by time-consuming thin layer chromatography (TLC) analysis. Furthermore, microsomal membrane preparations typically contain endogenous diacylglycerol acyltransferase (DGAT) from the host cells, and these DGAT activities can further acylate DAG to form triglyceride (TG). Our mass spectrometry (liquid chromatography-tandem mass spectrometry, or LC/MS/MS) MGAT2 assay measures human recombinant MGAT2-catalyzed formation of didecanoyl-glycerol from 1-decanoyl-rac-glycerol and decanoyl-CoA, to produce predominantly 1,3-didecanoyl-glycerol. Unlike 1,2-DAG, 1,3-didecanoyl-glycerol is proved to be not susceptible to further acylation to TG. 1,3-Didecanoyl-glycerol product can be readily solubilized and directly subjected to high-throughput mass spectrometry (HTMS) without further extraction in a 384-well format. We also have established the LC/MS/MS MGAT activity assay in the intestinal microsomes from various species. Our assay is proved to be highly sensitive, and thus it allows measurement of endogenous MGAT activity in cell lysates and tissue preparations. The implementation of the HTMS MGAT activity assay has facilitated the robust screening and evaluation of MGAT inhibitors for the treatment of metabolic diseases.
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