生体分析およびバイオ医薬品分析のための不均一なバイオ触媒としてのパパイン官能化金ナノ粒子

表面修飾金ナノ粒子（GNP）は、交互のカチオン性ポリアリルラミンとアニオン性ポリ（アクリル酸）高分子電解質層を介して層ごとのプロセスを介して合成されました。その後、パパインは、パパイン上のアミノ基と修飾GNPのアミノ基とのアミノ基との間のアミド結合を介して、N-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジミドおよびn-ヒドロクシスクシニミドオジミウムとしてのn-hydroxysuccinimidiumを使用することにより、共有結合して修飾GNPに固定されました。。結果として生じるパパイン官能化金ナノ粒子は、表面プラズモン共鳴、動的光散乱、ゼータの潜在的測定によって特徴付けられました。新しいテクノロジー共振質量測定は、フェムトグラムの範囲で単一ナノ粒子浮遊質量の測定により、GNPごとに固定化されたパパイン分子の平均数を決定するために適用されました。固定化酵素の活性は、標準的な色素原性基質Nα-ベンゾイル-Dl-アルギニン-4-ニトロアニリド塩酸塩を伴う運動パラメーター（km、vmaxおよびkcat）を測定することにより推定されました。kmの固定化および遊離酵素が同じ大きさであることがわかった。それどころか、GNP結合したパパインでは、KCATが著しく高くなっています。さらに、金ナノビオ触媒は、タンパク質断片を生成するためにポリクローナル免疫グロブリンGの消化に適用されました。得られたフラグメント混合物を、高速液体液体クロマトグラフィー - マクロエレクトロスプレーイオン化 - 四肢葉 - 飛行時間質質量分析によりさらに分析し、パパイン官能化GNPに基づくバイオリアクターの適用性を実証しました。固定化されたパパインは、より高い触媒活性とより良い安定性を持つだけでなく、再利用のための単純な遠心分離ステップによって反応媒体から簡単に分離することもできます。

Surface-modified gold nanoparticles (GNPs) were synthesized via layer-by-layer process with alternating cationic polyallylamine and anionic poly(acrylic acid) polyelectrolyte layers leading to a highly hydrophilic biocompatible shell supporting colloidal stability. Afterwards, papain was covalently immobilized on the modified GNPs via amide coupling between the amino groups on papain and the terminal carboxylic groups of the modified GNPs by using N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide and N-hydroxysulfosuccinimide sodium as coupling agents. The resultant papain-functionalized gold nanoparticles were characterized by surface plasmon resonance, dynamic light scattering and zeta potential measurements. The new technology resonant mass measurement was applied for determining the average number of papain molecules immobilized per GNP by measurement of the single nanoparticle buoyant mass in the range of femtograms. The activity of the immobilized enzyme was estimated by determination of the kinetic parameters (Km, Vmax and kcat) with the standard chromogenic substrate Nα-benzoyl-dl-arginine-4-nitroanilide hydrochloride. It was found that Km of immobilized and free enzyme are in the same order of magnitude. On contrary, turnover numbers kcat were significantly higher for GNP-conjugated papain. Further, the gold nanobiocatalyst was applied for digestion of polyclonal human immunoglobulin G to yield protein fragments. The resultant fragment mixture was further analyzed by high-performance liquid chromatography-microelectrospray ionization-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry, which demonstrated the applicability of the bioreactor based on papain functionalized GNPs. The immobilized papain not only has higher catalytic activity and better stability, but also can be easily isolated from the reaction medium by straightforward centrifugation steps for reuse.