転写因子SP1は、網膜微小血管内皮細胞におけるラウンドアバウト4の高血糖誘発アップレギュレーションを媒介します

RoundAbout4（Robo4）は、血管系で特異的に発現し、血管の血管新生と完全性に関与している遺伝子です。Robo4の発現レベルは、糖尿病性網膜症（DR）の発生とともに徐々に増加します。この研究では、網膜内皮細胞におけるrobo4の転写調節のメカニズムを調査し、高血糖条件下での細胞機能に対するこの調節の効果を調査しました。高血糖にさらされたヒト網膜内皮細胞（HREC）を使用して、RT-QPCRおよびウエスタンブロッティングによる特異性タンパク質1（SP1）およびROBO4の発現レベルを検出しました。SP1とRobo4の間の調節関係を分析するために、小さな干渉RNA（siRNA）トランスフェクション技術を使用しました。Robo4プロモーター活性に対する転写因子SP1の効果とSP1結合部位の位置を、クロマチン免疫沈降（CHIP）およびルシフェラーゼアッセイを使用して調査しました。細胞移動、単層透過性、およびチューブ形成アッセイを実施して、高血糖条件でのHREC関数の調節におけるSP1/RoBo4の役割を実証しました。結果は、高血糖がHRECにおけるSP1およびROBO4のmRNAおよびタンパク質レベルを上方制御したことを示した。siRNAトランスフェクションによるSP1の枯渇は、robo4の過剰発現を誘発する高血糖症を阻害しました。ルシフェラーゼアッセイと組み合わせたチップは、高血糖条件下で、SP1がRoBo4プロモーターの-1912/-1908の追加のSP1結合部位を介してRoBo4の転写レベルを有意に増加させることを示しました。SP1/ROBO4経路を抑制すると、高血糖によって誘発されるHREC移動、透過性、および血管新生の異常を効果的に緩和しました。これらすべての発見は、robo4の高血糖誘発アップレギュレーションがSP1の転写の強化によって媒介されることを示しています。SP1/ROBO4シグナル伝達経路は、高血糖条件下でHRECの移動能力、単層透過性、および血管新生を調節することができ、DR中の微小血管機能障害で重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。

Roundabout4 (Robo4) is a gene that is expressed specifically in vasculature and is involved in the angiogenesis and integrity of blood vessels. The expression level of Robo4 increases gradually along with the development of diabetic retinopathy (DR). In this study, we explored the mechanism of transcriptional regulation of Robo4 in retinal endothelial cells, and investigated the effects of this regulation on cellular functions under hyperglycemic conditions. Human retinal endothelial cells (HREC) exposed to hyperglycemia were used to detect the expression levels of specificity protein 1 (SP1) and Robo4 by RT-qPCR and western blotting. Small interfering RNA (SiRNA) transfection technology was used to analyze the regulatory relationship between SP1 and Robo4. The effect of transcription factor SP1 on Robo4 promoter activity and the location of SP1 binding sites were investigated using chromatin immunoprecipitation (ChIP) and luciferase assay. Cell migration, monolayer permeability and tube formation assays were performed to demonstrate the role of SP1/Robo4 in regulating HREC functions in hyperglycemic conditions. The results showed that hyperglycemia upregulated the mRNA and protein levels of SP1 and Robo4 in HREC. Depletion of SP1 by siRNA transfection inhibited the hyperglycemia induced overexpression of Robo4. ChIP combined with luciferase assay showed that under hyperglycemic conditions, SP1 significantly increased the transcriptional level of Robo4 via an additional SP1 binding site at -1912/-1908 in the Robo4 promoter. Repressing the SP1/Robo4 pathway effectively mitigated the abnormity in HREC migration, permeability and angiogenesis induced by hyperglycemia. All these findings indicate that hyperglycemia-induced upregulation of Robo4 is mediated by enhanced transcription of SP1. The SP1/Robo4 signaling pathway can regulate the migratory ability, monolayer permeability and angiogenesis of HREC under hyperglycemic conditions, suggesting that it may play an important role in microvascular dysfunction during DR.