T細胞受容体修飾のための非常に効率的なタレンとCRISPR/CAS9のゲノム全体の特異性

トランスジェニック高環境T細胞受容体（TCR）を持つT細胞では、内因性および転送されたTCR鎖が表面発現のために競合し、不適切にペアになり、潜在的に自己免疫を引き起こす可能性があります。内因性TCR発現をノックアウトするために、12の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALENS）と5つのガイドRNA（GRNA）を、定期的に交差した短パリンドロミックリピート（CRISPR）/CRISPR関連（CAS9）システムから組み立てました。Talen mRNAを使用して、TCRノックアウトはT細胞の最大81％で成功しました。さらに、レポーター導入遺伝子の治療的TCR鎖の置換に適したドナーを使用して、Talenターゲット部位での相同性化修復により、GFP遺伝子の標的遺伝子添加を検証することができました。驚くべきことに、Integrase-defective Lentiviral Vectorキャプチャを使用したTalenおよびCRISPR/CAS9特異性の分析により、GRNAの1つで1つのターゲットオフサイトと両方のタレンの3つのターゲット部位のみが明らかになり、高いレベルの特異性が示されました。集合的に、私たちの仕事は、T細胞工学のために非常に効率的かつ特異的なヌクレアーゼを示しています。

In T cells with transgenic high-avidity T cell receptors (TCRs), endogenous and transferred TCR chains compete for surface expression and may pair inappropriately, potentially causing autoimmunity. To knock out endogenous TCR expression, we assembled 12 transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and five guide RNAs (gRNAs) from the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas9) system. Using TALEN mRNA, TCR knockout was successful in up to 81% of T cells. Additionally, we were able to verify targeted gene addition of a GFP gene by homology-directed repair at the TALEN target site, using a donor suitable for replacement of the reporter transgene with therapeutic TCR chains. Remarkably, analysis of TALEN and CRISPR/Cas9 specificity using integrase-defective lentiviral vector capture revealed only one off-target site for one of the gRNAs and three off-target sites for both of the TALENs, indicating a high level of specificity. Collectively, our work shows highly efficient and specific nucleases for T cell engineering.