結合競争とT2緩和ベースの分解分析により、ヒト血清アルブミンと相互作用する「NMRに感じる」代謝産物を解き、定量化する

1H NMRによる低分子重量代謝産物（LMWM）の定量的プロファイリングは、ハイスループット血清メタボロミクスで日常的に使用されています。まず、タンパク質のバックグラウンドはT2フィルターを使用して減衰します。次に、LMWM信号はラインシェイプフィッティングによって解決されます。ただし、タンパク質結合はLMWMの運動特性を変更し、それらのシグナルはタンパク質のバックグラウンドとともにT2フィルターで部分的に減衰します。その結果、定量化されたLMWMシグナルは、血清の総濃度ではなく、非結合部分を反映しています。ここでは、血清タンパク質からの「NMRに感知できない」代謝物の放出を促進し、総濃度に近い定量化を実現するために、結合競争に基づいた新しい戦略を提示します。この研究は、異なる結合特性（バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン）を持つ5つの臨床的に関連するアミノ酸に焦点を当てています。血清模倣サンプルにおけるヒト血清アルブミン（HSA）への結合親和性を分析し、TSP滴定による結合画分の放出を促進しました。さらに、擬似-2D CPMGと多変量曲線解像度分析の新しい組み合わせを使用し、LMWMとタンパク質シグナルの分離を可能にし、横方向の弛緩効果のために修正されたLMWM定量を提供しました。3 mmを超えるTSP濃度が結合画分のほとんどを放出し、これらの所見を実際の血清/血漿サンプルで検証したことがわかりました。

Quantitative profiling of low-molecular-weight metabolites (LMWMs) by 1H NMR is routinely used in high-throughput serum metabolomics. First, the protein background is attenuated using a T2 filter; then, the LMWM signals are resolved by line-shape fitting. However, protein-binding modifies the motional properties of LMWM, and their signal partially attenuates with the T2 filter, along with the protein background. Consequently, the quantified LMWM signals do not reflect the total concentration in serum but the nonbinding part. Here we present a novel strategy based on binding competition to promote the release of the "NMR-invisible" metabolites from serum proteins and achieve quantifications closer to total concentrations. The study focuses on five clinically relevant amino acids with different binding properties (valine, isoleucine, leucine, tyrosine, and phenylalanine). We analyzed their binding affinity to human serum albumin (HSA) in serum mimic samples and promoted the release of their bound fraction by TSP titration. Furthermore, we used a novel combination of pseudo-2D CPMG and multivariate curve resolution analysis, allowing the separation of LMWM and protein signals and providing LMWM quantifications corrected for transverse relaxation effects. We found that TSP concentrations larger than 3 mM released most of the bound fraction and validated these findings in real serum/plasma samples.