ヒト誘導多能性幹細胞における安定および高導入遺伝子発現のためのレトロウイルスベクターとプロモーター構成の詳細な比較

レトロウイルスベクターを介した遺伝子送達時に患者特異的誘導多能性幹細胞（IPSC）の補正は、単遺伝子疾患の新しい治療の視点を提供します。遺伝子修飾IPSCクローンは、安全な統合部位のためにスクリーニングされ、対象の移植可能な細胞に分化できます。ただし、現在のボトルネックはエピジェネティックなベクターサイレンシングです。iPSCで最も適切なレトロウイルス発現システムを特定するために、異なるレトロウイルス属、異なるプロモーター、およびそれらの遍在性クロマチン開口要素（UCOE）といくつかのエンベロープ偽型のベクトルを体系的に比較しました。水槽の口内炎ウイルス糖タンパク質で偽型を添加したレンチウイルスベクター（LV）は、試験した尿細胞筋およびアルファレトロウイルスベクターおよびその他の封筒よりも優れていました。伸長因子1αショート（EFS）プロモーターは最も堅牢な発現を媒介しましたが、発現レベルは強力であるがよりサイレンシングしやすい脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーターから低かった。2つの生理学的プロモーターと1つのウイルスプロモーターに並置されたフルレングス（A2UCOE）と最小（CBX3）UCOEの両方が、等しい効率で導入遺伝子サイレンシングを減少させました。ただし、発現レベルのプロモーター固有の低下は完全には防止されませんでした。導入遺伝子陽性のiPSCが内皮細胞に分化すると、A2UCOE.EFおよびCBX3.EFSベクターは、ここでテストされた他のすべてのコンストラクトと比較して、より多くの細胞で最も高い導入遺伝子発現を維持しました。UCOEの機能は減少しましたが、完全に対抗しませんでした。ベクターサイレンシングと改善の可能性は残っています。それにもかかわらず、LVバックグラウンドのCBX3.EFは、ヒトiPSCとその子孫の高力価生産と長期遺伝子修飾の両方で最も有望なプロモーターとベクター構成を示しました。

Correction of patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSC) upon gene delivery through retroviral vectors offers new treatment perspectives for monogenetic diseases. Gene-modified iPSC clones can be screened for safe integration sites and differentiated into transplantable cells of interest. However, the current bottleneck is epigenetic vector silencing. In order to identify the most suitable retroviral expression system in iPSC, we systematically compared vectors from different retroviral genera, different promoters and their combination with ubiquitous chromatin opening elements (UCOE), and several envelope pseudotypes. Lentiviral vectors (LV) pseudotyped with vesicular stomatitis virus glycoprotein were superior to gammaretroviral and alpharetroviral vectors and other envelopes tested. The elongation factor 1α short (EFS) promoter mediated the most robust expression, whereas expression levels were lower from the potent but more silencing-prone spleen focus forming virus (SFFV) promoter. Both full-length (A2UCOE) and minimal (CBX3) UCOE juxtaposed to two physiological and one viral promoter reduced transgene silencing with equal efficiency. However, a promoter-specific decline in expression levels was not entirely prevented. Upon differentiation of transgene-positive iPSC into endothelial cells, A2UCOE.EFS and CBX3.EFS vectors maintained highest transgene expression in a larger fraction of cells as compared with all other constructs tested here. The function of UCOE diminished, but did not fully counteract, vector silencing and possibilities for improvements remain. Nevertheless, the CBX3.EFS in a LV background exhibited the most promising promoter and vector configuration for both high titer production and long-term genetic modification of human iPSC and their progeny.