遺伝的にエンコードされた蛍光一酸化窒素の適用（no•no•）プローブ、ジェノップ、noのリアルタイムイメージングのための単一細胞のシグナル

一酸化窒素（no•）は小さなラジカルであり、哺乳類、細菌、植物の複数の重要な細胞機能を媒介します。in vivoおよびin vitroでNOを検出するための多数の方法が存在しているにもかかわらず、単一細胞レベルでのNOのリアルタイムモニタリングは非常に困難です。NOの生理学的または病理学的効果は、このラジカルの実際の濃度と滞留時間によって決定されます。したがって、no•のシングルセル検出を可能にする方法は非常に望ましいです。最近、単一の蛍光タンパク質ベースの遺伝的エンコードされた一酸化窒素（NO•）プローブ（GENOPS）を細胞NOに直接反応させ、したがってこのニーズに対処することにより、NOのパレットを拡張しました。ここでは、2つの異なる化学的NOに応答した細胞内NOを評価するためのジェノップの使用を示します。また、我々の結果は、新たに調製された3-（2-ヒドロキシ-1-メチル-2-ニトロソヒドラジーノ）-N-メチル-1-プロパナミン（NOC-7）が、無機NOのニトロッサドナトリウム（SNP）と比較して、細胞内NOの変化を引き起こす可能性がはるかに高いことを確認しています。さらに、緑色のジェノップ（G-genop）と化学Ca2+インジケーターFura-2を使用したデュアルカラーライブセルイメージングを実行して、単一内皮細胞のCa2+依存性NO•形成の緊密な調節を視覚化しました。これらの代表的な実験は、ジェノップがリアルタイムの生成とシングルセルNOの劣化を調査するための適切なツールであることを示しています。

Nitric Oxide (NO•) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO• in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO• at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO• are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO• are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO• indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO• fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO• signals in response to two different chemical NO•-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO• levels as compared with the inorganic NO• donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO• formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO• signals in diverse experimental setups.