骨芽細胞におけるオートファジーおよびアポトーシスでのDMT1の調節

鉄の過負荷は最近、骨粗鬆症で発生する骨微細構造の変化に関連しています。ただし、骨芽細胞に対する鉄の過負荷の影響は不明です。この研究の目的は、骨粗鬆症の病理学的プロセスにおける二価金属輸送体1（DMT1）の機能を調査することでした。骨芽細胞HFOB1.19細胞は、鉄イオンのドナーとして異なる濃度（0、50、200、200、300、400、500μmol/L）のクエン酸鉄（FAC）を添加した培地で培養しました。ウェスタンブロッティングと免疫蛍光を使用して、FACでの治療後のDMT1のレベルを決定しました。アポトーシスは、クリーブカスパーゼ3、BCL2、およびBAXのレベルをウエスタンブロッティングで検出することにより評価されました。オートファジーは、ウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光でLC3のレベルを検出することにより評価されました。Beclin-1の発現は、ウエスタンブロッティングでも評価されました。オートファジー阻害剤3-メチルアデニンを使用して、オートファジーがFACによって誘導されるアポトーシスに影響するかどうかを判断しました。我々の結果は、FACがDMT1のレベルを増加させ、BCL2の発現を上方制御し、アポトーシス関連タンパク質がカスパーゼ3とBAXを切断したことをダウンレギュレートしたことを示しています。LC3I/LC3IIレベルとBeclin-1の両方が増加し、FACがHFOB1.19細胞のオートファゴソームの蓄積を増加させることを示しています。FAC誘発性オートファジーは、アポトーシス阻害剤3-MAによって増加しましたが、DMT1 shRNA HFOB1.19細胞で減少しました。これらの結果は、DMT1の発現の増加が鉄の過負荷を誘発し、鉄の過負荷が骨芽細胞のオートファジーとアポトーシスを誘導し、したがって骨粗鬆症の病理学的プロセスに影響を与えることを示唆しています。DMT1の効果の根底にあるメカニズムを明確にすることで、骨粗鬆症の予防と治療のための新しいターゲットを特定することができます。

Iron overload has recently been associated with the changes in the bone microstructure that occur in osteoporosis. However, the effect of iron overload on osteoblasts is unclear. The purpose of this study was to explore the function of divalent metal transporter 1 (DMT1) in the pathological processes of osteoporosis. Osteoblast hFOB1.19 cells were cultured in medium supplemented with different concentrations (0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 μmol/L) of ferric ammonium citrate (FAC) as a donor of ferric ions. We used western blotting and immunofluorescence to determine the levels of DMT1 after treatment with FAC. Apoptosis was evaluated by detecting the levels of cleaved caspase 3, BCL2, and BAX with western blotting. Autophagy was evaluated by detecting the levels of LC3 with western blotting and immunofluorescence. Beclin-1 expression was also assessed with western blotting. The autophagy inhibitor 3-methyladenine was used to determine whether autophagy affects the apoptosis induced by FAC. Our results show that FAC increased the levels of DMT1, upregulated the expression of BCL2, and downregulated the apoptosis-related proteins cleaved caspase 3 and BAX. Both LC3I/LC3II levels and beclin-1 were also increased, indicating that FAC increases the accumulation of autophagosomes in hFOB1.19 cells. FAC-induced autophagy was increased by the apoptosis inhibitor 3-MA but was reduced in DMT1 shRNA hFOB1.19 cells. These results suggest that the increased expression of DMT1 induces iron overload and iron overload induces osteoblast autophagy and apoptosis, thus affecting the pathological processes of osteoporosis. Clarifying the mechanisms underlying the effects of DMT1 will allow the identification of novel targets for the prevention and treatment of osteoporosis.