高解像度質量分析と結合した液体クロマトグラフィーによるネイティブおよびペルメチル化された母乳オリゴ糖の比較分析

母乳オリゴ糖（HMO）は、乳糖と脂質後の牛乳の3番目に豊富な成分を表しています。HMOは乳児に消化できないが、プレバイオティクスとして作用する可能性があり、受容体との相互作用を防ぐことにより、病原体（細菌やウイルスなど）に対する生物の防御に関して重要な生物学的機能を持つことができる。5つの異なる単糖ビルディングブロックのみで構成されていますが、HMOは非常に構造的に多様な化合物であり、多くの共存する構造異性体があります。ここでは、HMOを分析するために高解像度質量分析（LC-MS）に結合した液体クロマトグラフィーに基づいた2つの異なるグリコムプラットフォームの開発と比較を報告します。逆転位相（RP）および多孔質グラフィット炭素（PGC）カラムにペルメチル化と天然HMOのLC-MSを実装し、徹底的に比較しました。私たちのデータは、特に高感度でより正確な構造情報を取得するために、Permethylated誘導体としてHMOを分析することの有用性を本質的に強調しています。たとえば、浸透性は、MS/MS実験中にガス相フコース移動を消滅させるため、スペクトルの解釈を促進し、乏尿の分岐と異性体の区別に関する関連情報へのアクセスを提供します。反対に、牛乳中のネイティブHMOS（PGCを使用）のLC-MSプロファイリングは、検出された種の点で最も効果的に機能しましたが、サンプル調製の点でもはるかに高速です。PGCクロマトグラフィーよりも効率が低いが、RPLCはペルメチル化異性体HMOのペアを分離することに成功したことを証明した。PGC液体クロマトグラフィーよりもRPの重要な利点は、保持時間を分子量と相関させることができることです。これらのデータは全体として、ネイティブHMOのLC-MS分析（PGCを使用）をファーストラインプロファイリングアプローチとして使用できると考えるようになりますが、構造特性を促進するために透過性を実行することができます。

Human milk oligosaccharides (HMOs) represent the third most abundant components of milk after lactose and lipids. HMOs are indigestible by the suckling infant but can act as prebiotics and have significant biological functions regarding the organism defense against pathogens (such as bacteria or viruses) by preventing interactions with their receptors. Although constituted of only five distinct monosaccharide building blocks, HMOs are highly structurally diverse compounds with many co-existing structural isomers. Here we report the development and comparison of two distinct glycomic platforms based on liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-MS) for analyzing HMOs. We have implemented and thoroughly compared the LC-MS of permethylated and native HMOs on reversed phase (RP) and porous graphitic carbon (PGC) columns for their ability to resolve the natural heterogeneity of milk oligosaccharides at the highest sensitivity. Our data essentially underlines the usefulness of analyzing HMOs as permethylated derivatives especially for getting more precise structural information at high sensitivity. For instance, permethylation annihilates gas-phase fucose migration during MS/MS experiments, thus facilitating spectra interpretation and giving access to relevant information regarding oligosaccharide branching and isomer distinction. At the opposite, LC-MS profiling of native HMOs (using PGC) in milk performed best in terms of detected species, while also being much faster in terms of sample preparation. Although less efficient than PGC chromatography, RPLC proved successful for separating pairs of permethylated isomeric HMOs. A key advantage of RP over PGC liquid chromatography is that retention times can be correlated to molecular weights, which can greatly facilitate further HMO identification using retention time prediction. Altogether these data lead us to think that LC-MS analysis of native HMOs (using PGC) can be used as first-line profiling approach while permethylation can be performed afterwards for facilitating structural characterization.