ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる合成オリゴヌクレオチドプローブの非放射性標識

合成オリゴヌクレオチドは、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼを使用して 3' 末端でテールを付けられました。ビオチン-11-dUTPを参照として使用して、側鎖の末端に遊離の第一級アミンを持つヌクレオチド三リン酸のテーリング効率および/または検出感度を比較しました。遊離の第一級アミンは、活性化ビオチンまたはフルオレセイン イソチオシアネートでタグ付けされました。次に、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ複合体または抗フルオレセイン抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体のいずれかを使用してプローブを検出しました。テーリング条件が最適化され、大腸菌 ST1a エンテロトキシン DNA およびロタウイルス RNA の検出についてプローブがテストされました。

Synthetic oligonucleotides were tailed at the 3' end using terminal deoxynucleotidyl transferase. Nucleotide triphosphates with free primary amines at the end of side chains were compared for their tailing efficiency and/or detection sensitivity, using biotin-11-dUTP as a reference. Free primary amines were tagged with activated biotin or fluorescein isothiocyanate. The probes were then detected with either streptavidin-alkaline phosphatase complex or anti-fluorescein antibodies and alkaline phosphatase-conjugated secondary antibodies. Tailing conditions were optimized and the probes were tested for detection of Escherichia coli ST1a enterotoxin DNA and rotavirus RNA.