スピンセベラの運動失調における6つのStub1バリアントのin vitro特性評価は、エンコードされたチップタンパク質の構造特性の変化を明らかにします

紡糸性脳の運動失調症、常染色体劣性16（SCAR16）は、STIP1ホモロジーの二連変異とタンパク質1（Stub1）遺伝子を含むU-boxがユビキチンE3リガーゼとhsc70インタラクチャのタンパク質（CHIP）のダイマーなCo-Chaperone C末端をコードする遺伝子（Stub1）遺伝子によって引き起こされます。。疾患メカニズムは、チップの障害のE3ユビキチンリガーゼ特性および/またはそのシャペロンとの相互作用に関連していることが提案されています。ただし、これらの変異がチップ自体の安定性、折りたたみ、タンパク質構造にどのように影響するかについての知識は限られています。さらなる洞察を得るために、以前に報告された6つの病原性Stub1バリアント（E28K、N65S、K145Q、M211I、S236T、およびT246M）を組換えタンパク質として発現し、限られたタンパク質分解、サイズ閉塞クロマトグラフィー（SEC）、および環状ジクロム（CD）を使用して研究しました。。我々の結果は、N65Sが、野生型（WT）チップと比較して、チップ二量体化の増加、αヘリカル含有量の増加、および分解率の低下を示していることを明らかにしています。対照的に、T246Mは、凝集の強い傾向、より柔軟なタンパク質構造、αヘリック構造のレベルの低下、およびWTチップと比較して分解速度の増加を示しています。E28K、K145Q、M211I、およびS236Tは、N65SおよびT246Mで観察されたものよりも深刻ではありませんが、WTチップと比較して構造特性の欠陥も示しています。結論として、我々の結果は、劣性SCAR16を引き起こすことが知られているいくつかのStub1変異が、in vitroで二量体化するチップのタンパク質構造、安定性、および能力に大きな影響を与えることを示しています。これらの結果は、障害の背後にあるメカニズムに関する理解の高まりに追加されます。

Spinocerebellar ataxia, autosomal recessive 16 (SCAR16) is caused by biallelic mutations in the STIP1 homology and U-box containing protein 1 (STUB1) gene encoding the ubiquitin E3 ligase and dimeric co-chaperone C-terminus of Hsc70-interacting protein (CHIP). It has been proposed that the disease mechanism is related to CHIP's impaired E3 ubiquitin ligase properties and/or interaction with its chaperones. However, there is limited knowledge on how these mutations affect the stability, folding, and protein structure of CHIP itself. To gain further insight, six previously reported pathogenic STUB1 variants (E28K, N65S, K145Q, M211I, S236T, and T246M) were expressed as recombinant proteins and studied using limited proteolysis, size-exclusion chromatography (SEC), and circular dichroism (CD). Our results reveal that N65S shows increased CHIP dimerization, higher levels of α-helical content, and decreased degradation rate compared with wild-type (WT) CHIP. By contrast, T246M demonstrates a strong tendency for aggregation, a more flexible protein structure, decreased levels of α-helical structures, and increased degradation rate compared with WT CHIP. E28K, K145Q, M211I, and S236T also show defects on structural properties compared with WT CHIP, although less profound than what observed for N65S and T246M. In conclusion, our results illustrate that some STUB1 mutations known to cause recessive SCAR16 have a profound impact on the protein structure, stability, and ability of CHIP to dimerize in vitro. These results add to the growing understanding on the mechanisms behind the disorder.