バクテリオファージP1のCREリコンビナーゼによる哺乳類細胞における部位特異的DNA組換え

コリファージP1によってコードされるCREタンパク質は、38 kDaタンパク質であり、大腸菌とin vitroの両方で分子内および分子間シナプスとDNAの再結合の両方を効率的に促進します。再結合は、LOXと呼ばれる特定の部位で発生し、他のタンパク質因子は必要ありません。CREタンパク質は、哺乳類の細胞株でDNAのシナプスと部位特異的組換えを引き起こすことができるようにここに示されています。CD2+誘導性メタロチオネインI遺伝子プロモーターの制御下でCREタンパク質を発現する安定したマウス細胞株が確立されました。DNA組換えは、2つの直接繰り返されるLOX部位を含むDNA基質で監視されました。そのような基質の1つは、マーカー遺伝子に隣接する2つの直接繰り返されるLOX部位（LOX2）を備えた円形のプラスミドであり、Ca3（PO4）2変換によって細胞に導入されました。2番目の基質として、再結合のための高感度検出システムを提供するように設計されたLOX2挿入を含む偽菌ウイルス（ヘルペスウイルス）を使用しました。どちらの場合も、in vivoでの部位固有の組換えはCREタンパク質の存在に依存し、34塩基対LOX部位で特異的に発生します。これらの結果は、哺乳類細胞の原核生物タンパク質によるDNAおよび組換えの制御された部位特異的シナプスを示し、Creを介した部位特異的組換えが真核生物のゲノム再編成を理解および調節するための有用なツールであることを示唆しています。

The Cre protein encoded by the coliphage P1 is a 38-kDa protein that efficiently promotes both intra- and intermolecular synapsis and recombination of DNA both in Escherichia coli and in vitro. Recombination occurs at a specific site, called lox, and does not require any other protein factors. The Cre protein is shown here also to be able to cause synapsis of DNA and site-specific recombination in a mammalian cell line. A stable mouse cell line was established that expresses the Cre protein under the control of the Cd2+-inducible metallothionein I gene promoter. DNA recombination was monitored with DNA substrates containing two directly repeated lox sites. One such substrate is a circular plasmid with two directly repeated lox sites (lox2) flanking a marker gene and was introduced into cells by Ca3(PO4)2 transformation. As a second substrate we used a pseudorabies virus (a herpesvirus) containing a lox2 insertion designed to provide a sensitive detection system for recombination. In both cases, site-specific recombination in vivo is dependent on the presence of the Cre protein and occurs specifically at the 34-base-pair lox sites. These results demonstrate the controlled site-specific synapsis of DNA and recombination by a prokaryotic protein in mammalian cells and suggest that Cre-mediated site-specific recombination may be a useful tool for understanding and modulating genome rearrangements in eukaryotes.